活血化瘀中藥對人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株活血的影響及作用機(jī)制

王 生 張 晶 康 康 劉 洋

(唐山市工人醫(yī)院皮膚科，河北 唐山 063000)

老年人因激素分泌減少，皮膚腺功能減退和退行性萎縮，屏障功能喪失，易引發(fā)多種慢性皮膚病，銀屑病是其中常見的一種〔1〕。目前，銀屑病的發(fā)病機(jī)制仍未明確，臨床療效不夠理想，探尋安全有效的治療方案具有重要意義。有報道顯示，活血化瘀療法對瘀阻膚絡(luò)型的銀屑病有較好的療效〔2〕。本實驗通過腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株Ha-cat在體外模擬銀屑病表皮角質(zhì)細(xì)胞的過快增殖，觀察活血化瘀復(fù)方提取物對細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步分析細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平，初步探討其治療銀屑病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 Ha-cat細(xì)胞株購于上?；鄯f生物科技有限公司；活血化瘀復(fù)方：核桃、紅花、丹皮、丹參、玄參等組成，由本院藥劑科提供；細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒購于上海普飛生物技術(shù)有限公司；FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司；Bcl-2、Bax抗體購于美國CST中國分公司。

1.2方法

1.2.1活血化瘀復(fù)方制備 取活血化瘀復(fù)方中的藥材用清水煎煮3次，收集濾液，減壓濃縮后真空干燥，得到藥粉，冷藏保存待用。實驗前取藥粉1 g(相當(dāng)于原生藥2.95 g)，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液分別稀釋至20、25、30 g/L，調(diào)節(jié)pH7.0后使用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育Ha-cat細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×109/L，每孔1×106個細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至80%～90%融合，用50 μg/L TNF-α誘導(dǎo)24 h為模型組，模擬銀屑病表皮角質(zhì)細(xì)胞的過快增殖；再分別以濃度20、25、30 g/L的活血化瘀復(fù)方水提物作用造模后的細(xì)胞24 h為活血化瘀復(fù)方組；以全程僅加DMEM完全培養(yǎng)基的Ha-cat細(xì)胞為空白對照組。

1.2.3細(xì)胞增殖和凋亡情況檢測 制備Ha-cat細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×106/L，接種于96孔板中，分組同1.2.2，達(dá)到作用時間。①CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，向培養(yǎng)孔中滴加細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑，37℃ 5%CO2培養(yǎng)2 h，上酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度值，計算生長抑制率和IC50。②流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，0.25%胰酶消化相應(yīng)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，3 000 r/min離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后按試劑盒說明進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4Western印跡檢測細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) RIPA抽提Ha-cat細(xì)胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，調(diào)整濃度至5 g/L，加入緩沖液后95℃靜置10 min。配置分離膠和濃縮膠，待測蛋白樣品電泳，濕法轉(zhuǎn)移目標(biāo)蛋白至聚偏氟乙類(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉40 min，滴加Bcl-2抗體、Bax抗體，均為1∶1 000稀釋，內(nèi)參為β-actin抗體(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，次日滴加HRP標(biāo)記二抗，室溫靜置90 min，洗膜，ECL顯色，檢測各特異性條帶灰度值。

1.2.5RT-PCR檢測Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) Trizol提取Ha-cat細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Bcl-2上游引物：5′-CACCCCATCCCGACTGATCT-3′，下游引物：5′-TCTCTCCCTCCGGACTTCTC-3′，片段長度144 bp；Bax上游引物：5′-GTACCCGACCTGTAACCTGA-3′，下游引物：5′-TTTCATCCTCTCCTCCGGCA-3′，片段長度148 bp；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-ACTGCACCTGTAGGCGTTTC-3′，下游引物：5′-CACCTTCCACCTGTCGC TCC-3′，片段長度198 bp。擴(kuò)增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72℃ 5 s，55℃ 20 s。2-△△Ct法對Bcl-2、Bax基因行相對定量分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1活血化瘀復(fù)方對TNF-α誘導(dǎo)的Ha-cat細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 空白對照組Ha-cat細(xì)胞生長狀態(tài)良好，僅少量細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中；模型組細(xì)胞形態(tài)完整且生長迅速，已鋪滿近90%；活血化瘀復(fù)方組細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯下降，細(xì)胞體積縮小、間隙增大、碎片增多，細(xì)胞間連接減少或消失，但20 g/L劑量組改變程度較25、30 g/L劑量組輕微。見圖1。

2.2活血化瘀復(fù)方對TNF-α誘導(dǎo)的Ha-cat細(xì)胞增殖和凋亡的影響 活血化瘀復(fù)方各劑量組對Ha-cat細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于空白對照組〔(0.00±1.62)%〕和模型組〔(0.00±0.48)%，P<0.05〕；其中25、30 g/L劑量組對Ha-cat細(xì)胞增殖抑制程度〔(59.38±6.59)%、(67.73±2.68)%〕明顯高于20 g/L劑量組〔(9.51±4.93)%，P<0.05〕。模型組Ha-cat細(xì)胞凋亡率〔(4.25±1.37)%〕明顯低于空白對照組〔(6.75±0.93)%，P<0.05〕；活血化瘀復(fù)方各劑量組細(xì)胞凋亡率均明顯高于空白對照組和模型組(P<0.05)；其中30 g/L劑量組〔(29.88±3.20)%〕對Ha-cat細(xì)胞凋亡的促進(jìn)程度明顯高于20、25 g/L劑量組〔(8.61±1.59)%,(13.08±3.61)%，P<0.05〕。

2.3各組Ha-cat細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達(dá)情況 模型組Ha-cat細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均明顯低于空白對照組(P<0.05)；活血化瘀復(fù)方組各劑量組Bax mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均明顯高于模型組，且隨劑量的增加逐漸提升(P<0.05)；活血化瘀復(fù)方組各劑量組Bcl-2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量與模型組相比雖有提升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖2。

圖1 各組Ha-cat細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×200)

表1 各組Ha-cat細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達(dá)量比較

與空白對照組相比：1)P<0.05；對模型組相比：2)P<0.05

1：空白對照組；2：模型組；3：20 g/L劑量組；4：25 g/L劑量組；5：30 g/L劑量組圖2 Western印跡檢測各組Ha-cat細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

3 討 論

細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，多種基因參與其中。相關(guān)研究顯示，Bcl-2家族可通過調(diào)控線粒體膜蛋白分泌和釋放，參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展〔3〕；Bax為Bcl-2的促凋亡基因，與Bcl-2中的抑制凋亡部分相互結(jié)合，發(fā)揮拮抗作用，二者共同調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程〔4〕。TNF-α在銀屑病發(fā)生中發(fā)揮重要作用：①TNF-α作為促炎因子，可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)相關(guān)通路，引發(fā)體內(nèi)強(qiáng)炎癥反應(yīng)〔5〕；②促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖〔6〕；③誘導(dǎo)T細(xì)胞VEGF mRNA高表達(dá)，而該因子在銀屑病增生斑塊形成等病理改變中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔7〕。

活血化瘀方是根據(jù)本科多年臨床經(jīng)驗總結(jié)而成，藥物包括桃仁、紅花、丹皮、玄參、丹參、雞血藤、雙花、蛇蛻、厚樸、甘草。桃仁、紅花破瘀通絡(luò)；丹參協(xié)同行心氣，暢血脈；久瘀必留伏陽，雙花清熱解毒，玄參滋陰降火解毒；丹皮涼血破瘀與雞血藤補(bǔ)血活血，推陳出新，加之配伍蛇蛻祛風(fēng)止癢，營潤肌膚，厚樸燥濕下氣，甘草調(diào)和諸藥，共奏活血化瘀；皮膚甲錯的銀屑病為瘀阻膚絡(luò)型，上述組方對其有較好的療效。經(jīng)前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，作用24 h，活血化瘀方粗提液對Ha-cat細(xì)胞的最小抑制濃度為20 g/L，半數(shù)致死量為24.50 g/L，相關(guān)系數(shù)為0.957；作用48 h，半數(shù)致死量為21.35 g/L，相關(guān)系數(shù)為0.872，已無明顯細(xì)胞周期。因此，最終將活血化瘀方粗提液干預(yù)的低、中、高濃度設(shè)定為20、25、30 g/L，作用24 h。

本研究顯示，活血化瘀復(fù)方各劑量組均可明顯抑制Ha-cat細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中25、30 g/L劑量組效果更明顯。進(jìn)一步分析顯示，給予活血化瘀復(fù)方干預(yù)后Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯提升，Bcl-2表達(dá)變化不明顯。提示Bax較Bcl-2與銀屑病發(fā)病更具相關(guān)性，Bax基因可改變角質(zhì)形成細(xì)胞分化水平，當(dāng)?shù)捅磉_(dá)時會引發(fā)過度增殖；活血化瘀復(fù)方可通過上調(diào)Bax基因表達(dá)，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，抑制Ha-cat細(xì)胞增殖，緩解銀屑病。同時，Bax基因可能通過與其他基因相互拮抗，而非Bcl-2基因，實現(xiàn)上述促凋亡調(diào)控作用，有待進(jìn)一步研究。

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