畜禽源益生菌的篩選及安全性研究

■胡振華 楊永平 楊 宇 葉勝強 王麗霞 鄧 兵 陳 星 龔 萍*

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北武漢430070；3.武漢市動物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢430016）

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們生活水平的大幅提高，食品安全、生活環(huán)境等話題已成為人們關(guān)注的焦點。曾在動物的生長發(fā)育、飼料轉(zhuǎn)化率、動物疫病防控等方面具有顯著效果的抗生素，其過量、長期及違規(guī)使用引起的細(xì)菌耐藥性和獸藥殘留問題[1-2]，也越來越受到人們的重視。尋找抗生素替代品用于預(yù)防疾病和促進動物生長成為世界范圍內(nèi)研究的熱點。其中，益生菌通過改善動物胃腸道微生態(tài)平衡進而促進動物健康生長，是飼用抗生素替代品的理想選擇之一。益生菌主要通過與腸道微生物之間、與宿主之間的相互作用而發(fā)揮作用[3]。益生菌可直接飼喂動物，在數(shù)量及種類上彌補腸道內(nèi)減少或缺乏的有益菌群，促進腸道內(nèi)乳酸菌等有益菌群的增殖，抑制大腸桿菌等致病菌的生長[4]，調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，增強機體免疫力[5]；可產(chǎn)生消化酶、氨基酸、維生素、乳酸、丁酸等多種有益物質(zhì)，促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，參與新陳代謝，促進動物生長[6]。益生菌添加到飼料中用于動物生產(chǎn)，不存在耐藥性的問題，而且無毒、無污染、無殘留，同時又可起到提高動物免疫力、提高動物生產(chǎn)性能的作用。

篩選出不同功能的益生菌，研究其益生功效及安全性是微生物研究中重要的一部分，因此，研究者長期以來都在尋求自己的優(yōu)良菌源。本文就目前畜禽源益生菌的篩選方法及安全性進行綜述，以期為畜禽優(yōu)良菌源的合理開發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 飼用益生菌的種類

并不是所有的微生物菌種都適用于微生態(tài)制劑的生產(chǎn)，益生菌應(yīng)具有無毒、生長繁殖快、能在腸道定植和抵抗病原菌等多種特性。我國農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2013）》中所列“飼用微生物”已達34種，按生物特性和作用特點大體可分為乳酸菌類（如雙歧桿菌、腸球菌等）、芽孢桿菌類（如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等）、酵母菌等[7]。其中乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱，為厭氧菌或兼性厭氧菌，是動物腸道中的原籍菌群，參與宿主正常的代謝生理活動。芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧、能產(chǎn)生內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌，具有抗逆性強、耐酸、耐膽鹽、耐高溫高壓等特性[1]。酵母菌是一類典型的兼性厭氧型單細(xì)胞真菌，在有氧和無氧條件下都能生存，且能使糖發(fā)酵分解成酒精和二氧化碳，是一種天然發(fā)酵劑。

2 畜禽源益生菌的篩選標(biāo)準(zhǔn)

篩選的益生菌要具有無毒、生長繁殖快、能在腸道定植和抵抗病原菌等多種特點，這樣后續(xù)的工作才具有意義。篩選益生菌時可參考以下標(biāo)準(zhǔn)[2，8-10]：①無毒、無致病性、無副作用，安全性是決定菌株能否成為益生菌的必要條件；②對胃腸道環(huán)境具有一定的耐受性；③可黏附定植于腸道上皮；④對大腸桿菌、沙門氏菌等常見病原菌具有一定的抑制能力；⑤具有潛能的候選益生菌必須進行分子鑒定。除了這些重要篩選標(biāo)準(zhǔn)，作為候選的益生菌還須具有其它的一些標(biāo)準(zhǔn)，比如具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等消化酶的能力、耐高溫或低溫、抗氧化、能減少NH3、H2S等臭味氣體的排放等。飼用微生態(tài)制劑的效果如何與所選菌種的好壞有著密切的關(guān)系，只有用于制造成品制劑的菌種性狀優(yōu)良，最終的產(chǎn)品才具有較高的品質(zhì)。

3 畜禽源益生菌的篩選

3.1 益生菌的鑒定

在益生菌的研究中，候選益生菌的準(zhǔn)確分類非常重要，也是益生菌安全性評價的基礎(chǔ)。FAO/WHO[10]建議采用表型鑒定和基因型鑒定相結(jié)合的方法對候選益生菌進行分類。特別在鑒定分離微生物的種屬水平時，最好采用分子技術(shù)[11]，因為單一的表型鑒定結(jié)果不夠充分。我國也已經(jīng)把分子技術(shù)納入到分離微生物的種屬鑒定中。常用的表型鑒定方法如：形態(tài)學(xué)評估、革蘭氏染色、生理生化反應(yīng)等，這些傳統(tǒng)的分離鑒定方法僅用于益生菌的初步篩選。目前分子技術(shù)已廣泛用于分離微生物的種屬鑒定，如：rRNA基因測序、蛋白質(zhì)分析、核型分析、PCR技術(shù)等，這些技術(shù)能夠?qū)σ嫔M行準(zhǔn)確的區(qū)分，幫助研究者確定菌株的種屬關(guān)系。然而16SrRNA基因序列分析是一種比較常用的微生物分類方法。

3.2 胃腸道環(huán)境耐受性

畜禽胃部的pH值相對比較低，能夠破壞大部分被攝入腸道內(nèi)的微生物。腸道內(nèi)膽汁鹽的濃度隨著時間變化，其中小腸部位膽汁鹽濃度平均在0.3%左右。益生菌要在畜禽腸道內(nèi)發(fā)揮益生功效必須具有酸耐受性和膽鹽耐受性。因此篩選益生菌要依次進行耐酸特性、耐膽鹽特性、人工胃液耐受性和人工腸液耐受性檢測。具體地，將初篩的菌株培養(yǎng)液分別接種于不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0等）的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，測定OD600nm；將初篩的菌株培養(yǎng)液分別接種于不同膽鹽濃度（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%等）的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，通過平板計數(shù)法計算活菌數(shù)；將初篩的菌株培養(yǎng)液接種于人工胃液、人工腸液中，37℃培養(yǎng)，分別在0、30、60、180 min采用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。目前對于胃腸道環(huán)境耐受性沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，評價的方法也不盡相同。馮媛媛等[12]建議選用人工模擬的胃腸液，但pH值、酶及膽鹽濃度應(yīng)盡可能與畜禽的胃腸液一致。因此研究者在篩選畜禽源益生菌時，要綜合考慮畜禽胃腸道環(huán)境中的pH值、酶、膽鹽以及個體等因素，這樣才能保證篩選出的益生菌在應(yīng)用時充分發(fā)揮益生功效。

3.3 黏附性

益生菌的黏附能力是評價該菌株是否能夠定植到腸道的一個決定因素，只有菌株定植到腸道內(nèi)才能發(fā)揮益生功效。研究表明黏附到腸黏膜上的益生菌具有提高機體免疫能力、平衡腸道菌群、減少病原菌數(shù)量等能力[13-14]。因此評價菌株的黏附能力是作為候選益生菌的一個重要指標(biāo)。評價菌株黏附性的方法主要有直接測定法和間接評價法。其中，直接測定法是采用體外構(gòu)建模型的方法評價菌株對上皮細(xì)胞或黏蛋白的黏附情況。體外細(xì)胞模型通常采用Caco-2、HT-29和HeLa細(xì)胞[15]，將等體積的菌株培養(yǎng)液接種于含有蓋玻片的細(xì)胞孔內(nèi)并培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合的細(xì)胞孔內(nèi)，孵育1～2 h，甲醇固定，革蘭氏染色，顯微觀察計數(shù)，計算黏附率。但該方法有一定的缺陷，可能不能完全反映體內(nèi)的黏附情況，通常情況下菌體與腸道上皮細(xì)胞之間存在一層黏液層，益生菌若與上皮細(xì)胞間發(fā)生作用引起特異應(yīng)答，首先需要黏附于黏液層[15]。因此，可采用體外黏蛋白模型評價菌株對黏蛋白的黏附特性，該模型常采用ELISA法進行。具體步驟為：①腸黏液蛋白的制備：刮取健康畜禽腸黏膜蛋白混合物，PBS混勻后離心收集上清。用BCA（Bicinchoninic Acid，二喹啉甲酸）法測定黏蛋白濃度，并調(diào)整濃度后-80℃保存?zhèn)溆?；②菌體懸液的制備：將菌株培養(yǎng)液離心去上清，PBS洗滌后重懸，并調(diào)整菌液濃度后4℃保存?zhèn)溆?；③體外黏附：在96孔酶標(biāo)板中加入調(diào)整好濃度的黏液蛋白100 μl/孔，4℃孵育過夜，使蛋白固定在細(xì)胞培養(yǎng)板上；用PBS沖洗以除去未固定的黏液蛋白，每孔加入100 μl菌體懸液，37℃孵1 h后用PBS沖洗以除去未黏附的細(xì)菌；最后加入0.1%的Triton X-100裂解液200 μl，釋放黏附的細(xì)菌，37℃孵育30 min；梯度稀釋后，采用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算黏附率。

間接評價法包括細(xì)菌表面的疏水性和自聚合力等，可間接反映其黏附性的強弱，疏水性或自聚合力越大，黏附性越高[16]。但不同菌株的表面疏水性和自聚合力與其黏附性的相關(guān)程度不同，有些呈正相關(guān)，有些可能不相關(guān)。因此，采用間接評價法時，需結(jié)合直接測定法的結(jié)果進行綜合評估。

3.4 抑菌能力

在養(yǎng)殖管理中不可避免的會引入大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌進入畜禽的腸道內(nèi)，進入腸道的病原菌會通過產(chǎn)生毒素和有害物質(zhì)減少腸道微生物的種類與數(shù)量，降低腸道微生物的多樣性[17]。腸道微生物多樣性的減少會降低腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抵御病原菌的能力。因此篩選具有抑菌能力的益生菌株是一個重要的因素。研究已經(jīng)表明，具有益生功效的益生菌能夠分泌細(xì)菌素類的抗菌活性物質(zhì)或者通過降低腸道pH值抑制病原菌的生長繁殖[18]，因此作為候選益生菌要具有一定的抑菌能力。目前常采用濾紙片擴散法、牛津杯法、平板打孔法、點種法以及雙層平板法篩選具有抑菌活力的菌株。以牛津杯法為例，將新鮮培養(yǎng)的指示菌（如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等）按1‰接種量加入已高壓滅菌的培養(yǎng)基中混勻倒平板。用鑷子將無菌牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，在牛津杯中加入初篩的菌株培養(yǎng)液，以加入原始培養(yǎng)基的牛津杯為對照，37℃培養(yǎng)過夜，測量抑菌圈直徑。無論采用哪種方法，所篩選的候選菌株都要結(jié)合體內(nèi)抑菌模型判斷該菌株的抑菌能力。

除了上述重要的篩選標(biāo)準(zhǔn)之外，候選菌株的產(chǎn)酶能力、抗氧化、除NH3或H2S能力以及耐低溫或高溫等，研究者可根據(jù)研究目的或?qū)嶋H生產(chǎn)需求將上述標(biāo)準(zhǔn)以不同的加權(quán)值或選擇其中的部分標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，最終獲得各具功能的系列益生菌。

4 益生菌的安全性

目前，益生菌在食品和飼料工業(yè)領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并且商品化的益生菌在市場上日趨增多，如何對篩選的候選菌株進行有效的安全評估也越來越受到人們的關(guān)注。劉小杰等[19]報道畜禽源益生菌的安全性應(yīng)該包括：①應(yīng)用益生菌的來源和使用對象應(yīng)該一致；②益生菌必須來源于健康的動物；③益生菌必須對畜禽無致病性；④益生菌不能具有膽鹽水解酶活性；⑤益生菌不能攜帶可以轉(zhuǎn)移的抗抗生素基因；⑥益生菌不能產(chǎn)生對畜禽有毒的代謝產(chǎn)物。因此為了確保所篩選的候選菌株的安全性，需要對篩選菌株進行安全性評估。楊寶蘭等[20]指出益生菌的安全性至少對其進行耐藥性評價、代謝活性評估、對人體的副作用評估以及銷售后對其出現(xiàn)的相關(guān)副作用進行流行病學(xué)調(diào)查等。不同特性的益生菌菌株具有不同的評價方法和指標(biāo)，研究者要根據(jù)研究菌株的特性，選擇合適的指標(biāo)和方法對其進行安全性評估。畜禽源益生菌作為一種新型飼料添加劑越來越來受到飼料工業(yè)領(lǐng)域的關(guān)注，但其還存在許多不容忽視的問題，如產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物、抗生素抗性、存在一些毒性基因等。這些因素直接或間接和畜禽的生長、健康以及畜產(chǎn)品的安全有關(guān)。因此正確認(rèn)識和評價畜禽源益生菌的安全性是必要的。

5 益生菌的發(fā)展前景

隨著抗生素在畜牧業(yè)中的大量廣泛使用所引發(fā)的耐藥性、食品殘留、機體免疫力下降、環(huán)境破壞等一系列問題，尋找抗生素替代品的研究已成為生物、農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的熱點。益生菌因其安全無毒、無副作用且效果顯著等優(yōu)點日益受到人們的關(guān)注。根據(jù)現(xiàn)階段益生菌在畜禽中的廣泛應(yīng)用和研究，表明益生菌作為抗生素的替代品具有較好的實際意義和良好的前景[7]。目前作為益生菌應(yīng)用到飼料添加劑中的微生物種類還很少，還有很多具有益生特性的菌種有待進一步的開發(fā)，如根據(jù)生產(chǎn)需求篩選高黏附性、高產(chǎn)蛋白酶、高抑菌活性、耐低溫、高頡頏NH3等具有不同優(yōu)良特性的菌株。當(dāng)前為提高益生菌添加劑的作用效果，充分利用不同微生物的協(xié)同作用，可將多種益生菌配套組合，形成復(fù)合益生菌制劑。另外，酶制劑、植物提取物等也可作為飼料添加劑，不同種類的添加劑具有不同的優(yōu)勢，可聯(lián)合使用協(xié)同作用，形成復(fù)合微生物制劑，發(fā)揮更顯著的效果。飼用微生物制劑的研究還應(yīng)該根據(jù)不同生長階段的不同動物種類及不同的目的（如促進生長、防治疾病、改善環(huán)境等），選擇不同的益生菌菌種[8]。將針對性地篩選出的益生菌及研制的復(fù)合微生物制劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，促進畜禽的生長，改善畜禽生長環(huán)境，提高經(jīng)濟效益。