沙棘黃酮檢測(cè)方法概述

陳 春

(1.山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012;2.國(guó)家林業(yè)局沙棘工程技術(shù)研究中心，山西 太原 030012)

沙棘為藥食兩用植物，一直以來(lái)都作為傳統(tǒng)藥物被用來(lái)治療疾病，收錄于《中國(guó)藥典》。沙棘含有多種化合物，包括黃酮類(lèi)化合物、類(lèi)胡蘿卜素、甾醇類(lèi)、生育酚、脂類(lèi)，還含有抗壞血酸、單寧等物質(zhì)[1]，具有抗菌消炎、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、治療高血壓和腦溢血、抗癌等作用。沙棘黃酮主要包括異鼠李素、槲皮素、山奈酚、楊梅素等黃酮苷元及其苷類(lèi)物質(zhì)[2]?，F(xiàn)在，可從沙棘中分離出的黃酮類(lèi)化合物達(dá)32種[3]，且含量較高。例如，中國(guó)沙棘果實(shí)每100 g含有黃酮885.4 mg；西藏沙棘果實(shí)的黃酮含量更高，每100 g含1 104.7 mg 黃酮。

沙棘黃酮含量作為評(píng)價(jià)沙棘品質(zhì)的常見(jiàn)指標(biāo)，其主要檢測(cè)方法包括：光譜分析法、色譜分析法、電化學(xué)分析法、化學(xué)發(fā)光法等。筆者對(duì)各檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，旨在為今后沙棘黃酮的研究、開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供一定的參考。

1 光譜分析方法

1.1 紫外分光光度法

黃酮類(lèi)化合物在紫外光圖譜上主要有2個(gè)吸收帶，環(huán)肉桂酰類(lèi)物質(zhì)在300 nm～550 nm產(chǎn)生的吸收帶以及環(huán)苯酰類(lèi)物質(zhì)在240 nm～280 nm產(chǎn)生的吸收帶[4]。通過(guò)對(duì)光譜區(qū)的吸光度值進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)溶液濃度和吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算可得到目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的濃度值。利用紫外分光光度法檢測(cè)沙棘黃酮含量具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好且檢測(cè)技術(shù)易于掌握、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)[5]。紫外分光光度法檢測(cè)沙棘黃酮，具體又分為以下3種方法：亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法、硝酸鋁-醋酸鉀法和三氯化鋁法。

1.1.1 亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法

亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法是沙棘黃酮檢測(cè)較為常見(jiàn)的方法之一，在氫氧化鈉提供的堿性環(huán)境條件下，金屬鋁離子與沙棘黃酮類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物[6,7]。在對(duì)沙棘不同部位的黃酮進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，雖然對(duì)照品都是蘆丁，但最大吸收波長(zhǎng)和使用的乙醇溶劑濃度不同。沙棘葉、果部位吸收波長(zhǎng)為510 nm，而果渣為500 nm；沙棘葉使用乙醇溶劑的濃度為70%，沙棘果為35%乙醇，沙棘果渣為30%乙醇[8]。因此，在用亞硝酸鈉-氯化鋁-氫氧化鈉法檢測(cè)沙棘黃酮時(shí)，要嚴(yán)格控制溶劑的濃度、試劑的添加時(shí)間、顯色時(shí)間等，盡可能減少操作誤差。

1.1.2 硝酸鋁-醋酸鉀法

硝酸鋁-醋酸鉀法檢測(cè)沙棘黃酮含量，是依據(jù)鋁離子同黃酮類(lèi)化合物中的3位羥基、4位羰基或5位羥基、4位羰基或鄰二酚羥基發(fā)生反應(yīng)，生成絡(luò)合物，使得吸收峰紅移，從而測(cè)定出黃酮的含量[9]。

1.1.3 三氯化鋁法

三氯化鋁法的原理是在酸性條件下，沙棘黃酮醇母核中的5位羥基、4位羰基與金屬鋁離子絡(luò)合產(chǎn)生物對(duì)400 nm波長(zhǎng)有最大吸收[10]。利用三氯化鋁法對(duì)沙棘黃酮進(jìn)行測(cè)定時(shí)，應(yīng)根據(jù)黃酮含量的不同選擇不同的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，包括蘆丁、槲皮素和異鼠李素，并且使用不同濃度的乙醇溶解[11]。

1.2 熒光分光光度法

熒光分光光度法(flourescence)的原理是：紫外線照射在由黃酮類(lèi)物質(zhì)與特定的金屬離子絡(luò)合產(chǎn)生的絡(luò)合物上時(shí)會(huì)產(chǎn)生熒光，在一定的條件下，熒光的強(qiáng)度與絡(luò)合物的濃度呈正相關(guān)，由此可以得到待測(cè)物質(zhì)中黃酮類(lèi)物質(zhì)的總含量。雖然熒光光度法靈敏度高，準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性較好，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，在科研和生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用于植物黃酮的檢測(cè)報(bào)道較多[12,13]，但是應(yīng)用于沙棘黃酮檢測(cè)的報(bào)道較少[14]，有待進(jìn)一步深入研究。

2 色譜分析方法

2.1 高效液相色譜法

黃酮類(lèi)物質(zhì)均具有不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、分子離子峰穩(wěn)定，游離的苷元難溶或不溶于水、易溶于有機(jī)溶劑，黃酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑[15]的特點(diǎn)。因?yàn)辄S酮苷具有極性強(qiáng)、難氣化、不穩(wěn)定的特點(diǎn)，所以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)是重要的沙棘黃酮檢測(cè)方法。高效液相色譜法采用高壓液泵、高效固定相、液體流動(dòng)相、高壓輸出進(jìn)行檢測(cè)分析，具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可以得到沙棘待測(cè)樣品中各個(gè)黃酮組分的具體含量數(shù)值[16]。但也存在檢測(cè)設(shè)備昂貴、消耗流動(dòng)相較多、檢測(cè)成本高的缺點(diǎn)。當(dāng)前使用較多的是反相高效液相色譜[17，18]，分離柱為C8柱和C18柱，以甲醛-水、乙腈-水為流動(dòng)相。流動(dòng)相的選擇會(huì)直接影響出峰時(shí)間、分離度，可以通過(guò)調(diào)節(jié) pH 值來(lái)改善色譜圖的峰型。

2.2 薄層色譜法

薄層色譜法(TLCS)是將色譜技術(shù)和光密度計(jì)、電子計(jì)算機(jī)相結(jié)合的一種儀器分析方法。一定波長(zhǎng)的光照射在薄層上，對(duì)薄層色譜中有紫外或可見(jiàn)光吸收的斑點(diǎn)，或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描到的圖譜及積分值換算為藥品的質(zhì)量。薄層色譜法具有多通道效應(yīng)，可以同時(shí)平行分離分析多個(gè)待測(cè)的沙棘樣品；流動(dòng)相色譜使用量也較高效液相色譜少，且更換方便；對(duì)樣品的預(yù)處理要求也不高[19-21]。薄層色譜法是中藥制劑檢驗(yàn)中較為常用的分析方法，在《中國(guó)藥典》中有33個(gè)中成藥品種采用該法進(jìn)行含量測(cè)定。在沙棘黃酮檢測(cè)中也有使用，方法簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,可作為沙棘黃酮檢測(cè)的優(yōu)選方法之一。

2.3 超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜法(Super Fluid Chromatography，SFC)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種新型色譜技術(shù)。它具有氣相和液相色譜所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn),能分離、分析氣相和液相色譜不能解決的一些對(duì)象,應(yīng)用廣泛,發(fā)展迅速。在使用超臨界流體色譜法檢測(cè)黃酮時(shí)，利用超臨界流體或添加了改性劑的超臨界流體做流動(dòng)相，使黃酮單體分離后測(cè)定。目前該方法主要用于銀杏葉黃酮的檢測(cè)[22,23]，對(duì)沙棘總黃酮含量檢測(cè)應(yīng)用的相對(duì)較少[24]。

3 毛細(xì)管電泳電化學(xué)法

毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis, CE)又稱高效毛細(xì)管電泳(Highperfor-mance capillary electrophoresis, HPCE),是一種應(yīng)用非常廣泛的分離分析技術(shù)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的樣品分離檢測(cè)[25]。毛細(xì)管電泳具有高靈敏度、高分辨率、高速度，分離檢測(cè)用時(shí)少、樣品和流動(dòng)相用量少、成本低的優(yōu)點(diǎn)[26]。毛細(xì)管電泳電化學(xué)法是近年來(lái)發(fā)展迅速的分析檢測(cè)方法之一，也被應(yīng)用在沙棘黃酮的檢測(cè)分析中[27]，但有待進(jìn)一步發(fā)展。

4 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法

流動(dòng)注射分析(Flow Injection Analysis, FIA)是在非平衡熱力學(xué)條件下,在液流中重現(xiàn)地處理試樣或試劑區(qū)帶的定量流動(dòng)分析技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或發(fā)光總量來(lái)確定反應(yīng)中各組分的含量。將流動(dòng)注射分析與化學(xué)發(fā)光結(jié)合形成的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法(CL-FIA),是痕量分析法,具有分析速度快、線性范圍寬、精度和靈敏度較高、成本低和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[28],主要應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境檢測(cè)以及元素分析等領(lǐng)域[29]。早在20世紀(jì)90年代初，已被應(yīng)用于沙棘的檢測(cè)了[30]，但沒(méi)有得到推廣。

5 結(jié)論

對(duì)以上4類(lèi)方法進(jìn)行比較，可以看出，各種方法在實(shí)際使用過(guò)程中各有利弊。紫外分光光度法是廣泛使用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易于學(xué)習(xí)掌握，使用的檢測(cè)儀器較為便宜，但也存在易受雜質(zhì)干擾、穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)。光譜分析法中的高效液相色譜法不僅具有抗干擾、重現(xiàn)性穩(wěn)定、分離效能高、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，而且可以精確的檢測(cè)沙棘總黃酮中各個(gè)具體成分的含量，是目前沙棘總黃酮檢測(cè)的主流趨勢(shì)。其它檢測(cè)方法在沙棘總黃酮檢測(cè)中應(yīng)用較少，一方面是受使用儀器設(shè)備所限，不利于推廣普及；另一方面是應(yīng)用于沙棘總黃酮檢測(cè)時(shí)，方法還不夠成熟穩(wěn)定，有待進(jìn)一步探索研究。

隨著人們對(duì)沙棘黃酮作用的深刻認(rèn)識(shí)，黃酮提取技術(shù)的不斷提高，以及儀器分析技術(shù)的日益進(jìn)步，沙棘黃酮的檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)將來(lái)一定會(huì)更方便快捷、準(zhǔn)確可靠。