甜蕎組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

王蘭香，劉志雄

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

甜蕎(FagopyrumesculentumMoench.)是蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)非禾谷類食藥同源的經(jīng)濟(jì)作物，其種子富含賴氨酸、蘆丁和抗氧化活性物等，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效。甜蕎還具有生育期短、耐瘠薄、抗旱耐澇抗等優(yōu)點(diǎn)，在亞洲、歐洲、北美等地區(qū)廣泛栽培，是一種集營養(yǎng)保健、醫(yī)藥、蜜源和觀賞等多用途的經(jīng)濟(jì)作物[1,2]。然而，甜蕎自然群體內(nèi)長雌蕊短雄蕊(pin型)和短雌蕊長雄蕊(thrum型)花植株呈1∶1分離，僅pin和thrum型植株花間相互授粉能正常結(jié)實(shí)，自花或同型花間授粉不親和，自然結(jié)實(shí)率低，雜交育種困難；另外，甜蕎的無限花序?qū)е峦恢仓晟踔镣换ㄐ蛏洗嬖诓煌l(fā)育時(shí)期的籽粒，很難確定合適的收獲時(shí)間，不利于機(jī)械化采收，加之落粒性嚴(yán)重，嚴(yán)重制約著這一重要經(jīng)濟(jì)作物的推廣應(yīng)用。創(chuàng)制甜蕎新種質(zhì)，是加快這一重要經(jīng)濟(jì)作物推廣應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)因具有繁殖系數(shù)高、繁殖周期短、繁殖速度快且不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)、種質(zhì)資源保存、基因工程育種等方面?；谥参锝M織培養(yǎng)技術(shù)的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，是利用基因工程創(chuàng)制甜蕎新種質(zhì)的基礎(chǔ)和前提，同時(shí)還能為甜蕎的倍性育種積累資料和技術(shù)。目前，國內(nèi)外均已建立了完整的甜蕎離體培養(yǎng)體系，但存在著愈傷組織褐化嚴(yán)重、繼代培養(yǎng)困難、再生率低等問題。關(guān)于甜蕎體細(xì)胞胚胎發(fā)生也有報(bào)道，但通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的植株再生率較低，且發(fā)生體系尚不完善。在綜述近年國內(nèi)外關(guān)于甜蕎組織培養(yǎng)研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，分析目前甜蕎組織培養(yǎng)面臨的技術(shù)難題和瓶頸，并對(duì)后期的研究方向進(jìn)行展望，以期為建立甜蕎離體培養(yǎng)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系積累資料并提供參考。

1 種子無菌萌發(fā)

種子無菌萌發(fā)是以成熟種子經(jīng)人工脫毒后在無菌條件下萌發(fā)長成幼苗的一種繁殖途徑，多用于解決種子休眠或萌發(fā)困難等問題，在甜蕎組織培養(yǎng)中則是用來獲得無菌的外植體材料。成熟的甜蕎種子人工去皮后，經(jīng)0.1% HgCl2或2 % NaClO浸泡滅菌15～18min，殺菌消毒，后接入無激素MS培養(yǎng)基中即可萌發(fā)，與NaClO相比，HgCI2滅菌效果較好。

金紅等[3]將成熟甜蕎種子剝?nèi)シN皮，用0.1%HgCI2(含少量吐溫-80)溶液滅菌18min后接種到無激素MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)獲得無菌苗。陳佳[4]對(duì)甜蕎無菌苗的萌發(fā)培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化，將人工去皮后的成熟種子用2 %NaClO的溶液滅菌15min后接入到1/2 MS中，其光照培養(yǎng)條件下萌發(fā)率高達(dá)78%。

2 外植體選擇與預(yù)處理

2.1 外植體的選擇

植物的細(xì)胞、組織、器官均可作為組織培養(yǎng)的外植體，但不同類型外植體的愈傷誘導(dǎo)及植株再生能力存在著一定的差異。在甜蕎組織培養(yǎng)中，無菌苗子葉和下胚軸是較為常用的外植體[3,5～7]，其幼嫩莖段[8]、葉柄[9]、未成熟胚[10,11]、未成熟花序[12]、花藥[13]、原生質(zhì)體[14]等，經(jīng)愈傷誘導(dǎo)后均能成功獲得再生植株。而同屬的苦蕎(FagopyrumtataricumGaertn.)和金蕎麥[Fagopyrumdibotrys( D.Don) Hara]，除無菌苗的子葉和下胚軸外[15～17]，葉片[18]、葉柄[19]、莖段[20]、腋芽[21]也可作為外植體，經(jīng)愈傷誘導(dǎo)后均能成功獲得再生植株。

前人研究表明，甜蕎幼嫩莖段形成愈傷組織的能力高于葉片，且愈傷組織生長較快[6]。當(dāng)用子葉作外植體的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)中，子葉上容易長出細(xì)白的毛狀根，甚至不產(chǎn)生愈傷組織[22]。而以莖段為外植體時(shí)，靠近頂芽部分的實(shí)心莖段最佳，空心莖段不易于消毒滅菌且褐化嚴(yán)重[8]。在同一培養(yǎng)基中，甜蕎下胚軸的分化率明顯高于子葉[23]。同樣，在相同培養(yǎng)條件下，苦蕎下胚軸的愈傷誘導(dǎo)率和分化率均高于子葉[16]。由此可見，在蕎麥屬植物中，無論是甜蕎還是苦蕎，下胚軸比子葉更適合用作離體培養(yǎng)的外植體。

2.2 外植體的預(yù)處理

正常情況下，甜蕎5～15d苗齡的無菌幼苗、子葉和下胚軸是較為理想的外植體。但若選取自然生長的甜蕎器官作外植體，則要進(jìn)行一定的預(yù)處理。王愛國等[24]用不同的消毒方式處理甜蕎外植體發(fā)現(xiàn)，經(jīng)70%酒精消毒殺菌30s后，轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2消毒滅菌10min，滅菌效果最好。對(duì)于開花期前的甜蕎頂端幼嫩的實(shí)心莖段，經(jīng)0.1%HgCl2消毒3min，無菌水清洗數(shù)次后即可接入到培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織[8]。 Neskovic等[10]以甜蕎未成熟胚為外植體時(shí)，用0.1%HgCl2中消毒10min，再在商業(yè)次氯酸鈉(0.4%活性氯)中消毒20min，無菌水清洗數(shù)次后接入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷，獲得再生植株。黃仁術(shù)等[25]對(duì)金蕎帶節(jié)莖段的HgCl2消毒時(shí)間進(jìn)行研究，在濃度為0.1%HgCl2溶液中，最佳消毒時(shí)間為6min。

3 器官發(fā)生途徑

器官發(fā)生途徑是甜蕎組織培養(yǎng)中主要的再生途徑，分為直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生，從外植體上直接分化不定芽為直接器官發(fā)生方式，外植體經(jīng)過脫分化誘導(dǎo)的愈傷組織上分化不定芽從而形成完整植株為間接器官發(fā)生方式。

3.1 愈傷組織誘導(dǎo)

植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體脫分化形成愈傷組織有著至關(guān)重要的作用，不同外植體在組織培養(yǎng)中可直接或間接形成不定芽，培養(yǎng)基中激素種類與濃度是外植體愈傷誘導(dǎo)與形態(tài)建成的主要因素。以甜蕎腋芽為外植體時(shí)，在MS+6-BA 4.0mg/L+TDZ 0.06mg/L培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)叢生芽，其分化率達(dá)166.7%[26]。趙鋼等[8]研究表明，2,4-D、6-BA、KT對(duì)甜蕎幼嫩莖段的愈傷誘導(dǎo)均有促進(jìn)作用，2,4-D的效果最為顯著，甜蕎莖段愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為2,4-D 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L的MS培養(yǎng)基。柴瑞娟等[27]以甜蕎幼莖、幼葉為外植體，在MS+2,4-D 7.0mg/L+6-BA 0.5mg/L培養(yǎng)基上，幼莖愈傷誘導(dǎo)率為100%，幼葉的愈傷誘導(dǎo)率也達(dá)到97.3%。甜蕎子葉和下胚軸在2,4-D 1.5～2.0mg/L+6-BA 0.5～1.5mg/L的MS培養(yǎng)基上即可大量誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)率可以達(dá)到100%，葉片和葉柄在此激素濃度范圍內(nèi)，愈傷誘導(dǎo)率也較高[7,9,23]。

與甜蕎相比，苦蕎和金蕎在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中，所需激素濃度略有不同。王躍華等[19]對(duì)苦蕎葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中，隨著2,4-D濃度在1.0～4.0mg/L范圍內(nèi)逐漸增高，愈傷誘導(dǎo)率也隨之升高，當(dāng)2,4-D濃度為4.0mg/L時(shí)愈傷誘導(dǎo)率為100%，而6-BA對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)的影響不顯著。吳崇明等[16]以苦蕎子葉和下胚軸為外植體，在IAA 0.1mg/L+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+TDZ 0.5mg/L的MS培養(yǎng)基上，子葉愈傷誘導(dǎo)率達(dá)75%左右，下胚軸愈傷誘導(dǎo)率可高達(dá)86.62 %，抗氧化劑AgNO3能有效降低愈傷組織褐化率。而金蕎葉片在2,4-D 4.0mg/L+6-BA 1.0mg/L的MS培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)率達(dá)89%[18]。

3.2 愈傷組織增殖及分化

甜蕎的愈傷組織在繼代、分化培養(yǎng)過程中，容易發(fā)生褐化，且隨著繼代時(shí)間的延長，愈傷組織的分化能力逐漸降低且褐化程度加重。陳發(fā)菊等[6]認(rèn)為適宜甜蕎愈傷組織生長的激素組合為 2.4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L。JIN等[28]研究表明，大約21.5%的甜蕎愈傷組織在MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 1.5mg/L的培養(yǎng)基中繼代近1年后轉(zhuǎn)至MS+6-BA 2.0mg/L+KT l.0mg/L的培養(yǎng)基中能夠分化叢生芽。Lee等[29]研究發(fā)現(xiàn)，甜蕎子葉在含有BAP 4.0mg/L的MS培養(yǎng)基上所獲得的再生芽數(shù)量與相同濃度的KT相比差異顯著，培養(yǎng)基中添加7mg/L AgNO3大大改善了芽再生頻率，其比對(duì)照組高約30%。在6-BA 2.0mg/L+IAA 0.lmg/L+KT lmg/L的MS培養(yǎng)基上，子葉和下胚軸的分化率分別為42.5%和73.6%，下胚軸的分化率明顯高于子葉[23]。Veroslava等[30]研究了赤霉素(GA3)對(duì)甜蕎子葉器官發(fā)生的影響，結(jié)果表明赤霉素對(duì)愈傷誘導(dǎo)沒有抑制作用，而對(duì)器官發(fā)生抑制作用顯著。

Mangkita等[31]用3周齡的幼芽為材料，建立了苦蕎的快繁體系，在添加20μmol/L BAP、3%蔗糖和1g/L結(jié)冷膠的改良MS培養(yǎng)基上，6周即可獲得大量叢生芽。閆超敏等[32]研究表明，在MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L培養(yǎng)基上，九江苦蕎愈傷組織芽分化率為26.9%，伴有玻璃化現(xiàn)象。陳彩霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)金蕎麥愈傷組織分化不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+TDZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L。而林靜等[20]發(fā)現(xiàn)在1/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L(或 IBA 0.3mg/L)+2,4-D 0.1mg/L培養(yǎng)基上，金蕎愈傷組織最快1個(gè)月重量增加約3倍。

4 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑

胚胎發(fā)生途徑是離體培養(yǎng)過程中從體細(xì)胞中產(chǎn)生的胚狀體，不經(jīng)過性細(xì)胞融合但發(fā)育過程與合子胚相似，由外植體脫分化直接形成或外植體先誘導(dǎo)愈傷再脫分化間接形成。外植體類型、外源激素種類和濃度對(duì)甜蕎體細(xì)胞胚胎的發(fā)生至關(guān)重要，2,4-D、6-BA、KT是甜蕎體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)中常用的外源激素，因外植體不同，所需激素濃度和種類均有不同。

Sun Hee等[33]將甜蕎子葉在含有2,4-D 2.0mg/L+KIN 0.2mg/L的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷后，將脆性愈傷組織在KIN 0.2mg/L+BAP 2.0mg/L+3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎，其發(fā)生率為32%。Kwon等[34]以甜蕎下胚軸誘導(dǎo)獲得的黃色易脆的愈傷轉(zhuǎn)接到IAA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L中培養(yǎng)2周后分化出體細(xì)胞胚。Gumerova等[35]在含有2,4-D(6mg/L)的液體B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)甜蕎下胚軸6周后分化出原始細(xì)胞復(fù)合物(Proembryogenic Cell Complexes)，但在高濃度2,4-D(8mg/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8d即可獲得大量的原始細(xì)胞復(fù)合物，隨后轉(zhuǎn)至不含或少量2,4-D(0～2.0mg/L)的培養(yǎng)基中，分化出體細(xì)胞胚胎并獲得完整植株。Neskovic等[10]將甜蕎幼胚在添加有2,4-D和KT的B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后轉(zhuǎn)至含有BAP 2.2mg/L和IAA 0.17mg/L的培養(yǎng)基中，能夠產(chǎn)生體細(xì)胞胚的愈傷組織。李占旗[15]將苦蕎子葉和下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到2,4-D 2.0mg/L+KT 0.1mg/L的MS培養(yǎng)基上繼代，胚性愈傷誘導(dǎo)率都高。Cheng 等[36]對(duì)苦蕎品種“西昌”、“園子”無菌苗的子葉和下胚軸體胚發(fā)生的研究，“園子”下胚軸在2,4-D 2.0mg/L+KT 1.0mg/L的MS培養(yǎng)基上體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率為98.96%，子葉體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率為84.36%，下胚軸比子葉適合誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。

5 植株再生

將愈傷分化和體細(xì)胞胚胎分化獲得的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，以獲得完整的再生植株。甜蕎不定芽的生根培養(yǎng)基主要有MS和1/2MS 2種，生根培養(yǎng)所需的生長素與細(xì)胞分裂素的濃度比例與甜蕎品種有關(guān)。

甜蕎品種北早生的離體培養(yǎng)體系中，不定芽接種于NAA 0.6mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上生根率100%，經(jīng)煉苗后移栽存活率可達(dá)70%以上[4]。陳發(fā)菊等[6]將甜蕎不定芽接種到含MS+IBA 2.0mg/L+KT 0.1mg/L 的培養(yǎng)基上，根的誘導(dǎo)率可達(dá)78.9%。陳利紅等[23]將甜蕎愈傷組織中分化出生長狀態(tài)良好的不定芽，轉(zhuǎn)接到含有IBA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上生根，所有轉(zhuǎn)接的不定芽均可生根。Lee等[29]認(rèn)為在不添加植物激素的MS培養(yǎng)基中，甜蕎不定芽也可以正常生根，煉苗移栽后存活率為72%。Hou[37]對(duì)溫莎甜蕎和九江苦蕎的再生體系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NAA與6-BA的比例為1.0～2.0時(shí)，九江苦蕎比溫莎甜蕎的再生率高，表明不同基因型的蕎麥對(duì)植物激素的敏感度不同。吳崇明等[16]、王躍華等[19]對(duì)苦蕎再生體系的研究中表明，苦蕎不定芽在MS+IBA 0.5mg/L和1/2MS+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上，根的誘導(dǎo)率分別為85.0%和50.0%，經(jīng)煉苗后移栽于松軟的土壤中，成活率達(dá)90%。

6 結(jié)語

與大宗作物相比，甜蕎的離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系嚴(yán)重滯后，雖已有完整的甜蕎離體培養(yǎng)體系，但依然存在著愈傷組織褐化嚴(yán)重、分化率低的問題，尤其是體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑。降低愈傷組織褐化和提高分化率是目前甜蕎離體培養(yǎng)體系亟待優(yōu)化的2個(gè)方面。甜蕎、苦蕎、金蕎3種蕎麥的愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)中，外植體類型和激素濃度的差異可能是基因型不同而引起的。

隨著生活水平的提高，人們?cè)陲嬍撤矫娓幼非缶G色、健康，甜蕎的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值也逐漸被認(rèn)識(shí)，對(duì)甜蕎的需求量也越來越大。然而在栽培過程中，其籽粒成熟期不一致且落粒嚴(yán)重，產(chǎn)量低。不斷完善甜蕎離體培養(yǎng)體系，對(duì)于外源優(yōu)良基因的遺傳轉(zhuǎn)化、優(yōu)質(zhì)新品種的選育具有重要意義。穩(wěn)定、高效的再生體系，有利于甜蕎遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程育種等方面的深入研究，為甜蕎品種改良及培育新品種積累材料和技術(shù)，進(jìn)而改變甜蕎現(xiàn)有的性狀，提高產(chǎn)量及抗性。