植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究進展

陶阿麗，曹殿潔，華芳，李勝男，楊梅蘭

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥 230088)

植物組織培養(yǎng)(plant tissue culture)作為一種新興技術(shù)，是指在離體條件下，將植物的離體器官(如植物根尖、莖尖、葉、花、種子等)、組織(如花藥組織、皮層等)、細胞(體細胞、生殖細胞等)、胚胎及原生質(zhì)體在無菌前提下作為外植體在人工創(chuàng)造的合適條件下，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽等，使其長成完整個體的技術(shù)，統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng)技術(shù)[1，2]。目前，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在植物離體快速繁殖、苗木脫毒、細胞突變體篩選、基因(轉(zhuǎn)基因)育種、遺傳資源保存等方面得到了普遍的應(yīng)用。

1 植物組織培養(yǎng)新技術(shù)的應(yīng)用

國內(nèi)外學者通過結(jié)合環(huán)境控制技術(shù)與植物組織培養(yǎng)技術(shù)的方法，在提高組培苗生長速度、提高組培苗質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本這幾個方面建立了一些新技術(shù)和方法。

1.1 開放式組培技術(shù)

崔剛等[3]進行開放式組培的抑菌劑研究，建立了一套比較完整的植物開放式組培模式，在地被菊、矮牽牛、金葉連翹、繡球、紅掌、蝴蝶蘭等多種觀賞植物上應(yīng)用開放式組培技術(shù)，均獲得成功。趙青華等[4]進行魔芋開放式組培研究，成功解決了有菌環(huán)境下魔芋組培的污染問題，簡化了組培環(huán)節(jié)，減少了生產(chǎn)成本。何松林等[5]在有菌環(huán)境下進行文心蘭組培接種操作，在培養(yǎng)基中加入了殺菌劑NaClO，試管苗在培養(yǎng)過程中未發(fā)生污染現(xiàn)象，可正常生長。陳瑞丹等[6]對梅花莖段開放式組培進行了初步研究，并取得一定效果。陳澤斌等[7]利用藍莓開放組培探究了抑菌劑在開放式組培中的作用及其應(yīng)用前景。

1.2 光自養(yǎng)組培技術(shù)

采用CO2氣體代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)基中的糖作為碳源給不同種類的組培苗提供適宜的生長條件，從而使植株能快速繁殖出優(yōu)質(zhì)種苗[8，9]。光自養(yǎng)組培技術(shù)目前已經(jīng)成功應(yīng)用于半夏、草莓、花椰菜等植物的培養(yǎng)中，并且獲得了很好的成效。李傳業(yè)等[10]設(shè)計開發(fā)了無糖組培微環(huán)境控制系統(tǒng)。屈云慧等[11]研究了虎眼萬年青的再生芽無糖培養(yǎng)生根, 結(jié)果表明，在無糖培養(yǎng)的基質(zhì)上, 常規(guī)組培技術(shù)中發(fā)生污染的幾率明顯減少, 在一定程度上提高了成苗率。其后無糖組培技術(shù)在滿天星[12]、圓葉海棠[13]、燈盞花[14]等植物中均取得了較好的效果。

1.3 新型光源的應(yīng)用

侯甲男等[15]以鐵皮石斛原球莖及試管苗為材料，研究發(fā)現(xiàn)采用適當比例的CCFL光源的光質(zhì)配比，有利于組培苗的光合作用和干物質(zhì)積累。此外，新型光源還具有高效、節(jié)能、空間高效利用等優(yōu)點，在農(nóng)業(yè)和生物領(lǐng)域顯示巨大的應(yīng)用潛力。戴艷嬌等[16]通過研究新型光源輻射的不同光譜對蝴蝶蘭組培苗生根和形態(tài)、色素含量、葉片碳氮代謝以及葉片酶系活性的影響，發(fā)現(xiàn)單色紅光處理的蝴蝶蘭組培苗徒長, RBG (紅光/藍光/綠光) 處理組全部生根, 單色藍光處理的組培苗根系活力最高。除了已進入組培應(yīng)用期的新型光源LED外，冷陰極熒光燈(CCLF)在此方面的應(yīng)用也正在開發(fā)。

2 植物育種方面

2.1 單倍體育種

單倍體育種能夠縮短育種年限、節(jié)約成本、提高育種效率以及擴展種質(zhì)資源，因而成為作物遺傳育種的重要手段。將單倍體育種應(yīng)用于生長周期長的林業(yè)生產(chǎn)中效果尤為顯著。在楊柳科的楊屬中，花粉誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率、綠苗分化率等都可達到較高水平。

目前我國通過花藥培養(yǎng)已率先培育出重要農(nóng)作物、經(jīng)濟作物40余種，其中含水稻新品種近20種，煙草、小麥新品種近10種[17]。劉勇等[18]利用單倍體技術(shù)獲得雙抗TMV(煙草花葉病毒)和PVY(煙草馬鈴薯Y病毒)的煙草株系。楊懷衛(wèi)[19]從單倍體獲取途徑、單倍體的加倍方式以及單倍體的誘導(dǎo)因素等方面進一步完善了玉米單倍體育種的研究。通過花藥培養(yǎng)選育出了水稻單豐1號、花育1號、花育2號、中花系列粳稻品種、合江21號、龍粳系列粳稻品種。國內(nèi)利用花藥培養(yǎng)技術(shù)培育出小麥京花系列、甘春16號、豫麥系列、花培系列、冀麥42、楊麥9號、陜農(nóng)28號等品種，并在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用。

2.2 胚胎育種

胚培養(yǎng)是指在人工干預(yù)的方式下，在無菌環(huán)境中將植物成熟和未成熟胚從種子中剝離，然后在人工創(chuàng)造的培養(yǎng)基上對植株進行培養(yǎng)，使其成長為正常植株形態(tài)的一種培養(yǎng)方式。目前胚胎發(fā)育的機制、消除胚心珠的干擾、克服植物自交與雜交不親和、突破種子休眠、減短育種周期、建立植物高效再生系統(tǒng)等都是該項技術(shù)的主要應(yīng)用范疇[20，21]。

目前我國已獲得的由植物胚乳培養(yǎng)而來的植物再生植株有10余種。賈思齊等[22]從胚胎離體培養(yǎng)及其在育種中的應(yīng)用、真假雜種的鑒定與再生植株的加倍3個方面綜述了目前改良現(xiàn)有蕓薹屬植物品種的重要手段是通過利用子房離體培養(yǎng)克服遠緣雜交受精后胚胎發(fā)生障礙,借此來獲得蕓薹屬較遠親緣關(guān)系屬、種間雜交的再生植株, 奠定了進一步選育出新的品種的基礎(chǔ)。曾瑞香等[23]以采自牡丹芍藥育種基地的雜交牡丹種子為試驗材料，通過不同類型的外植體接種的比較、不同發(fā)育時期胚的啟動效果比較以及胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的選擇試驗，為保存和擴繁牡丹雜種種質(zhì)資源而提供牡丹組培苗的菌根化供試體系，為牡丹菌根化組培苗培養(yǎng)研究提供有利的理論基礎(chǔ)。孫麗娜等[24]以連農(nóng)923種子為試驗材料，在前人研究的基礎(chǔ)上，通過對比不同外植體對培養(yǎng)效果的影響以及探究不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，獲得了最佳接種方式與最佳培養(yǎng)基。

2.3 細胞融合育種

細胞融合育種是通過植物脫細胞壁后仍有活力原生質(zhì)體的融合，而能消除植物種屬間的遠緣雜交不親和性障礙的一種育種方式[25]。曹雪等[26]簡述了目前主流的原生質(zhì)體融合方法，分別為PEG-高Ca2+高pH融合法、電融合法。鄭錦榮[27]通過利用原生質(zhì)體融合技術(shù)嘗試培育能在中高溫環(huán)境下生長出菇的金針菇新菌株和生長周期短的巨大口蘑新菌株。李鴻梅等[28]以羅爾阿太菌菌株AY6657741為試驗材料，用玉米淀粉和玉米黃漿作為試驗培養(yǎng)基，并采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出羅爾阿太菌，其菌株AY-3多糖的產(chǎn)量有了明顯提高。公維亮等[29]通過對原生質(zhì)體制備中甘氨酸濃度、溶菌酶濃度以及溶菌酶酶解時間的考察，再利用ARTP誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出了那西肽高產(chǎn)菌株。

3 植物基因工程方面

3.1 基因轉(zhuǎn)化方面

通過在植物細胞中導(dǎo)入外源基因，待其在植物體內(nèi)表達并遺傳，就能使植物性狀發(fā)生定向改變，從而增強作物抵抗惡劣環(huán)境的能力，改良作物性狀[30]。

在楊樹的基因工程育種中，通過導(dǎo)入抗蟲基因Bt基因、抗病基因(抗病毒基因和抗菌基因)、抗除草劑基因、抗逆基因、降級木質(zhì)素基因和雄性不育基因等來進行物種的遺傳改良[31，32]。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍這2種方式是應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因操作的主要途徑[33]，在方法應(yīng)用過程中，常通過向培養(yǎng)基中添加對植物細胞無毒害作用的抑菌性抗生素這一手段來抑制農(nóng)桿菌的生長，從而避免細菌過度滋長造成的污染．研究認為，用于基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)應(yīng)具有80%以上的再生頻率[34]。王燕等[35]通過pCAMBIA1301-SAL質(zhì)粒的構(gòu)建，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化為煙草，再利用RT-PCR的檢測成功獲得了SAL的轉(zhuǎn)基因煙草，同時為進一步研究苦豆子凝集素基因的功能奠定了基礎(chǔ)。曹必好等[36]將表面消毒的“油青四九”菜心種子播種于1/2 MS培養(yǎng)基，取培養(yǎng)了4d的無菌苗帶柄子葉作為外植體，采用CTAB法提取菜心植株DNA和RNA，并利用根癌農(nóng)桿菌導(dǎo)入法等對菜心進行研究，再通過分子生物學鑒定后發(fā)現(xiàn)利用未轉(zhuǎn)化植株與雄性的轉(zhuǎn)基因不育植株雜交獲得的后代能分離出50%的不育植株，為未來開展菜心優(yōu)勢育種提供了更好的實驗數(shù)據(jù)。吳曉慶等[37]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)ACO基因，獲得了花期延長的石竹材料。

3.2 選育細胞突變體

大量研究資料顯示，由于愈傷組織和細胞在培養(yǎng)過程中不斷進行分生，受培養(yǎng)條件和外界環(huán)境的影響，經(jīng)常有突變體出現(xiàn)。例如在梁山慈竹的叢生芽誘導(dǎo)方面，NO.66-2與NO.29誘導(dǎo)率明顯高于梁山慈竹實生植株；較高濃度的6-BA和KT對NO.29植株叢生芽誘導(dǎo)具有一定促進作用，當6-BA濃度為3.0mg/L，KT為0.1mg/L時NO.29的增殖系數(shù)較高[38,39]。邵秀紅等[40]對三倍體香蕉優(yōu)良品種Grand Nain進行了全基因組重測序及變異分析，并解析了乙烯合成代謝途徑基因的變異，以期為香蕉貯藏保鮮等相關(guān)性狀的遺傳改良提供理論依據(jù)。通過物理、生物或化學方法處理得到的變異基因型為新品種的篩選和培育提供了更多的可選擇性。從細胞水平上選擇突變體具有選擇效率高、節(jié)省時間、節(jié)約土地、不受自然環(huán)境限制等諸多優(yōu)點。戴林建等[41]通過對Li3+離子束輻照和花藥培養(yǎng)結(jié)合的方法所篩選出來的黑脛病突變體抗性明顯提高并可以穩(wěn)定遺傳。王艷芳等[42]通過航天搭載番茄種子選育出的突變體有可遺傳的無限生長習性。

4 保存種質(zhì)資源方面

目前僅有約200種植物誘導(dǎo)出體細胞胚，模式植物的體胚培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，如馬鈴薯的人工培育的種子在各個方面都優(yōu)于普通種子[43,44]。

目前，白芨的產(chǎn)量無法滿足日益增加的需求，致使白芨的價格越來越高。李偉平等[45]以萌發(fā)后的白芨種子為材料，經(jīng)過篩選得到了最佳的人工胚乳，利用人工種子技術(shù)快速繁殖白及幼苗，貯藏時間很長，為長途運輸也提供了不少便利。張桂芳等[46]將鐵皮石斛作為原材料進行種子無菌萌發(fā)，形成原球莖接種到增殖培養(yǎng)基上，經(jīng)過篩選得到的原球莖即為包埋體，通過探究人工胚乳中的不同成分產(chǎn)生的影響，最終建立了能有較高萌發(fā)率和成苗率的鐵皮石斛人工種子的制作方法。汪福源等[47]研究了繁殖白術(shù)的最佳配方，建立了白術(shù)人工種子繁殖體系。

5 植物體的快繁及脫毒

在植物體快繁方面，Morel和Martin在20世紀50年代初最先用被病毒感染的大麗花植株的莖尖分生組織培養(yǎng)出了無病毒植株[48]。快繁技術(shù)在我國得到了一定的開發(fā)及應(yīng)用，已經(jīng)涉及到觀賞植物、蔬菜、果樹、藥材等三百多種植物。在植物脫毒方面，脫毒后的馬鈴薯、甘蔗、大蒜、草莓、香蕉等作物的平均產(chǎn)量增加了30%以上。觀賞植物經(jīng)過脫毒后，植株變得生長勢強、花色艷麗、花朵增大、產(chǎn)量提高。王新等[49]通過大量研究與試驗表明鳳丹牡丹離體快繁技術(shù)是建立在基因型選擇的基礎(chǔ)上，而體系化是鳳丹牡丹離體快繁技術(shù)的關(guān)鍵。田增勝等[50]通過探討油桃莖尖增殖的影響因素，為早熟油桃莖尖快繁體系的建立奠定基礎(chǔ)。趙習武等[51]綜述了熱處理脫毒、化學療法、莖尖脫毒、花藥培養(yǎng)脫毒等脫毒方法的研究進展，認為其中莖尖脫毒是目前最成熟的一種脫毒方法，而花藥培養(yǎng)脫毒的脫毒率是100%，是未來研究的一個新方向。

6 結(jié)語

通過組織培養(yǎng)技術(shù)可縮短育種時間、減短培育周期，并大大提高作物品質(zhì)和增強抗病蟲害的能力，可由此建立基因庫保存種質(zhì)資源，還可提取用于食品、藥品及工業(yè)的植物次生代謝產(chǎn)物和用于外來引入物種的安全性檢疫等，這些應(yīng)用前景已引起各界的廣泛關(guān)注。隨著科研工作的不斷深入，組織培養(yǎng)技術(shù)會日益成熟和完善，在生產(chǎn)中的應(yīng)用也正朝著工廠化、規(guī)模化方向邁進。