circRNA生物學特性及其與肺癌關(guān)系的研究進展

鐘瓊慧，林晉，王小中

(南昌大學第二附屬醫(yī)院，南昌330006)

環(huán)狀RNA(circRNA)是繼微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)后被發(fā)現(xiàn)的另一種內(nèi)源性非編碼RNA，是RNA家族又一新的研究熱點。circRNA是一類通過反式剪接使得3′末端與5′末端共價結(jié)合形成的環(huán)狀RNA分子，具有序列保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高和特異性高的特性。circRNA具有多項生物學功能，能夠調(diào)控肺癌驅(qū)動基因和免疫治療靶點。本文對circRNA的生物學特性及其與肺癌的關(guān)系作一綜述，以期為circRNA在肺癌中的潛在作用提供新的思路和理論依據(jù)。

1 circRNA的生物學特性

1.1 circRNA的結(jié)構(gòu)與形成機制 circRNA被廣泛認知為非編碼RNA，但其確切的分子形成機制尚不明確。circRNA不同于線性RNA分子的生成機制，其分子沒有5′端“帽子結(jié)構(gòu)”和3′端“多聚腺苷尾”，而是以共價閉合環(huán)狀的形式結(jié)合在一起。由于這種閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circRNA不容易被核酸外切酶降解而穩(wěn)定存在[1]。circRNA分子以共轉(zhuǎn)錄的方式產(chǎn)生，且其生成速率主要由其內(nèi)含子序列決定。盲肌蛋白是與circRNA生物合成相關(guān)的一個因子，盲肌蛋白與側(cè)翼內(nèi)含子相互作用，促進外顯子環(huán)化[2]。也就是說，機體內(nèi)相當一部分circRNA以犧牲正常RNA為代價來生成。因此，circRNA的生成對于基因表達具有巨大影響，從而參與機體發(fā)育。

1.2 circRNA的分類 circRNA可能來自外顯子或內(nèi)含子，導致形成四種不同類型的circRNA分子。①外顯子來源的circRNA(ecRNA)：ecRNA的形成是mRNA前體剪接的結(jié)果，是3′剪接供體與5′剪接受體結(jié)合而形成的[3]。②外顯子-內(nèi)含子來源的circRNA(EIciRNA)：在circRNA的生成過程中，內(nèi)含子可能不會被完全切除，而是被保留在新生成circRNA中被包圍的外顯子之間；上游外顯子的起始點與下游外顯子的末端連接，使中間的RNA發(fā)生了環(huán)化，由此產(chǎn)生了EIciRNA[3]。③內(nèi)含子來源的circRNA(ciRNA)：在Ⅰ組內(nèi)含子、Ⅱ組內(nèi)含子、剪接體剪接和tRNA剪接的情況下，從前體RNA切除的序列可以形成環(huán)狀分子，這些被切除的內(nèi)含子中有一些可能是功能性RNA。功能性RNA在分支點2′-5′連接處被環(huán)化，從3′端降解到分支點，但以某種方式逃脫脫支和降解，因此形成ciRNA[4]。④基因間來源的cicrRNA[5, 6]：基因間來源的cicrRNA含有兩個由GT-AC剪接信號側(cè)接的內(nèi)含子circRNA片段，充當環(huán)形連接的剪接供體和受體，同時形成整合的circRNA。這種circRNA是通過circRNA Identifier檢測到的[7]。目前發(fā)現(xiàn)的circRNA主要來源于基因外顯子，占已鑒定的circRNA的80%以上[5, 8, 9]，但多項研究表明，circRNA的類型遠遠不止上述四種，仍有待進一步研究。

1.3 circRNA的特征 ①豐度高。在一些情況下，circRNA的豐度是相關(guān)線性mRNA豐度的10倍以上[3,6]。Jeck等[5]發(fā)現(xiàn)，在人成纖維細胞中circRNA占活躍轉(zhuǎn)錄基因的14.4%。②穩(wěn)定性高、半衰期長。相比線性RNA分子，circRNA分子以首尾相接的閉合環(huán)狀形式結(jié)合在一起，不容易被核酸外切酶降解而穩(wěn)定存在。Li等[10]發(fā)現(xiàn)，circRNA在血清外泌體中是穩(wěn)定存在的，其形態(tài)依舊是完整的圓形環(huán)狀。大部分circRNA的半衰期長于mRNA，大多數(shù)物種的circRNA半衰期超過48 h[5]，而mRNA的半衰期在10 h左右[11]。③序列保守性高。大多數(shù)circRNA在進化上序列保守[12]，僅有少數(shù)物種在進化上不保守[6, 9]。circRNA在物種間是保守的，如人類circ-Foxo3和小鼠circ-Foxo3的序列有91%是同源的[13]。④組織特異性高[9]。Memczak等[9]檢測了數(shù)千種circRNA，發(fā)現(xiàn)其通常表現(xiàn)為組織發(fā)展階段特異性。如CDR1as在腦組織中高表達，但在非神經(jīng)組織中表達很低或甚至無表達。hsa-circRNA 2149由CD19+白細胞中13個獨特的頭對尾跨越讀段表達，但在CD34+白細胞或HEK293細胞中未檢測到其表達[10]。⑤大多數(shù)來源于外顯子、少部分來源于內(nèi)含子[13]。在單細胞生物中，circRNA主要來源于核糖體RNA前體的自剪接內(nèi)含子[14]，也可能來自于古細菌的蛋白質(zhì)編碼基因[15]。

1.4 circRNA的功能 ①“海綿”作用。miRNA“海綿”是一種在細胞系和轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生連續(xù)miRNA功能喪失的手段。miRNA可以與circRNA結(jié)合，發(fā)揮其“海綿”作用。ciRS-7是用于miR-7海綿的環(huán)狀RNA[16]ciRS-7/CDR1as有約70個 miR-7結(jié)合位點，可以靶向 miR-7，從而抑制其生物功能。ciRs-7也被稱為小腦變性相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄物(CDR1as)的反義物，其在人和小鼠腦中高度表達，在斑馬魚中敲低miR-7或表達ciRs-7能夠抑制中腦發(fā)育[9]。雖然circRNA被認為具有miRNA“海綿”作用，但這是否是circRNA的一個普遍特征仍存在爭議[17]。②調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。circRNA可以通過與線性剪接相互競爭而在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，有一類特殊的circRNA能與RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)作用，通過小干擾RNA(siRNAs)或基于RNase H的反義寡核苷酸(ASOs)靶向EIciRNA，導致circEIF3J和circPAIP2基因表達下調(diào)，從而導致HeLa和HEK293細胞中親本基因mRNA表達降低[18]。研究表明，非編碼內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄物(ci-ankrd52)對其親代編碼基因的順式調(diào)控作用，與延伸PolⅡ機制相關(guān)聯(lián)，并作為PolⅡ轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控因子[6]。③與蛋白質(zhì)相互作用。circRNA可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)功能[2,9,13]。circMbl兩側(cè)內(nèi)含子中有許多甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)的結(jié)合位點，并且蛋白質(zhì)與circMbl之間有強烈而直接的相互作用。當?shù)鞍踪|(zhì)過量時，可以通過促進circMbl產(chǎn)生而減少自身mRNA生成，以此平衡兩者的產(chǎn)物生成[2]。另外，在保守的核苷酸中circRNA序列豐富，表明circRNA能與RNA結(jié)合蛋白(RBP)作用[9]。④翻譯功能。circRNA通常被認為是非編碼RNA[19]，無法進行蛋白質(zhì)翻譯。但近期有研究報道，circRNA是可以被翻譯的，真核細胞核糖體可以啟動在circRNA上的翻譯，但只有在RNA含有內(nèi)部核糖體進入位點元件的情況下才能進行[20]。水稻黃斑病毒相關(guān)病毒體來源的高度共價閉合環(huán)狀RNA(220 nt)可以編碼16 kDa的高度堿性蛋白質(zhì)；這種circRNA是所有已知的類病毒和擬病毒中最小的，也是唯一編碼蛋白質(zhì)的，其序列具有內(nèi)部核糖體進入位點，可通過兩個(或三個)完全重疊的開放閱讀框直接進行翻譯(在每輪結(jié)束時轉(zhuǎn)移到新的閱讀框)[21]。

2 circRNA與肺癌的關(guān)系

大多數(shù)原發(fā)于肺部的肺癌稱為原發(fā)性肺癌，絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管上皮組織。分子生物學認為，肺癌與原癌基因的突變或抑癌基因的失活有關(guān)。WHO將肺癌分為非小細胞肺癌(NSCLC) 和小細胞肺癌(SCLC)，前者組織學分類包括鱗癌、腺癌(包括肺泡細胞癌)和大細胞癌三大類。circRNA與NSCLC及SCLC的發(fā)生、發(fā)展均密切相關(guān)。

2.1 circRNA與NSCLC 與相鄰的正常組織相比，NSCLC組織存在異常表達的circRNA。Yao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高表達circRNA_100876的NSCLC患者總生存時間短于低表達者。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌(LAC)組織中hsa_circ_0012673表達高于相鄰的非腫瘤組織，并且與腫瘤大小相關(guān)。hsa_circ_0012673主要定位于細胞質(zhì)，通過在LAC靶向erb-b2受體酪氨酸激酶3 (ErbB3)的miR-22海綿作用來促進LAC細胞增殖。Zhu等[24]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0013958水平與NSCLC 患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并通過miR-134海綿作用上調(diào)致癌細胞周期蛋白D1表達，在LAC的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。hsa_circ_0013958可以作為潛在的非侵入性生物標志物用于LAC的早期檢測和篩選。Zhao等[25]發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_404833和hsa_circRNA_406483可能是肺腺癌的早期診斷標志物，hsa_circRNA_404833可能與miR-149-5p相互作用，從而降低細胞運動性，并參與肺腺癌獲得性吉非替尼耐藥機制。circRNA與NSCLC的癌變密切相關(guān)，可能成為NSCLC潛在的生物標志物和治療靶點。

2.2 circRNA與SCLC SCLC的惡性程度高于NSCLC，容易發(fā)生淋巴結(jié)及臟器轉(zhuǎn)移，治療以全身化療為主。ETS轉(zhuǎn)錄家族中FLI1基因來源的circFLI1 E2-4和circFLI1 E2-5在SCLC組織中表達上調(diào)，相較于NSCLC，circRNA對SCLC的影響更加顯著。circFLI1 E2-4和circFLI1 E2-5均與SCLC的轉(zhuǎn)移有關(guān)，但對SCLC細胞增殖、凋亡無明顯影響，且患者化療緩解后二者表達均下降。由此可見，circRNA不僅可以作為SCLC的診斷靶標，還可能成為SCLC患者預后的一個預測指標。

綜上所述，circRNA序列保守、含量豐富，具有組織發(fā)展階段特異性，具有miRNA“海綿”、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、結(jié)合蛋白及翻譯等多種生物學功能。目前，在肺癌中的研究多在于發(fā)現(xiàn)和篩選相關(guān)異常的circRNA等方面，隨著研究的深入將會在分子機制及信號通路方面進行更全面地發(fā)掘。circRNA作為一種新型的內(nèi)源性競爭性RNA，還有很多更深層次的生物學特性及分子作用機制有待探討。circRNA憑借其高穩(wěn)定性、高度保守、高豐度特性，有望成為新一代肺癌分子診斷的靶標及精準醫(yī)學的新研究熱點。