HOTAIR lncRNA對垂體生長激素腺瘤侵襲及激素分泌的影響

陳崗，宋長明，李九州

(1寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，銀川750001；2壽光市中醫(yī)醫(yī)院；3濱州市人民醫(yī)院)

垂體腺瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤之一，其中10%～20%為生長激素腺瘤[1～3]。垂體生長激素腺瘤可分泌過量的生長激素并誘導(dǎo)生成胰島素樣生長因子-I(insulin-like growth factor I，IGF-I)作用于全身器官，導(dǎo)致巨人癥、肢端肥大癥、代謝障礙和循環(huán)呼吸系統(tǒng)疾病等[4～6]。部分垂體生長激素腺瘤具有侵襲性生長的特性，可累及海綿竇、頸內(nèi)動脈等重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)風(fēng)險大，全切除困難，術(shù)后易復(fù)發(fā)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指長度超過200 nt、無蛋白編碼功能的RNA，多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。lncRNA可通過多種機(jī)制調(diào)控生物進(jìn)程[7～9]。目前已發(fā)現(xiàn)lncRNA的異常表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA中的HOX基因的反義基因間RNA(HOX transcript anti-sense intergenic RNA,HOTAIR)即HOTAIR lncRNA，被證實(shí)與乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，并可作為某些腫瘤診斷和預(yù)后判斷的一個重要標(biāo)志物[10,11]。但其在垂體生長激素腺瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲中的作用尚未明確。本研究觀察了非侵襲性垂體生長激素腺瘤和侵襲性垂體生長激素腺瘤組織中HOTAIR lncRNA的表達(dá)變化，同時干擾垂體瘤細(xì)胞株GH3的HOTAIR lncRNA表達(dá)并觀察其生長激素分泌及細(xì)胞侵襲性變化，探討HOTAIR lncRNA對垂體生長激素腺瘤侵襲和激素分泌的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年1月～2017年10月在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院和濱州市人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的初治垂體生長激素腺瘤患者51例，男23例，女28例；年齡19～67(50.2±5.7)歲；其中侵襲性垂體生長激素腺瘤17例，非侵襲性垂體生長激素腺瘤34例。正常垂體前葉來源于5例組織捐獻(xiàn)者，男3例，女2例，年齡30～59(37.2±4.6)歲；捐獻(xiàn)者均無神經(jīng)系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。垂體生長激素腺瘤組織和正常垂體前葉收集后保存于液氮中。本研究分別經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院和濱州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、試劑和儀器 垂體瘤細(xì)胞株GH3(為分泌過量生長激素的垂體瘤細(xì)胞)購于美國ATCC公司。TRIzol (Invitrogen，美國)、NanoDrop1000 (Thermo Scientific，美國)、第一鏈 cDNA 合成試劑盒(Invitrogen，美國)、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UD試劑盒(Invitrogen，美國)、ABI 7500 Fast system (Applied Biosystems，美國)、Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，美國)，Growth Hormone ELISA Kit (Abcam, ab108643，美國)。Transwell小室(Millipore，美國)。

1.3 垂體生長激素腺瘤組織和正常垂體前葉組織中的HOTAIR lncRNA mRNA檢測 取約100 mg受檢組織，TRIzol 提取總RNA，采用NanoDrop 1000明確其純度和濃度，A260/A280和A260/A230接近2.0。采用Platinum SYBR Green qPCR superMix-UD試劑盒建立25 μL反應(yīng)體系。HOTAIR lncRNA引物序列：正向(5′-3′)為GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC，反向(5′-3′)為ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC；內(nèi)參GAPDH引物序列：正向(5′-3′)為GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，反向(5′-3′)為CGCTCCTGGAAGATGGTGAT。擴(kuò)增調(diào)節(jié)：Hold stage為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；Cycling stage為95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；Melt curve stage為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。HOTAIR lncRNA mRNA相對表達(dá)量以2-ΔCt(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)表示。HOTAIR lncRNA mRNA表達(dá)量高低以中位數(shù)為界。

1.4 垂體瘤細(xì)胞株GH3的HOTAIR lncRNA表達(dá)干擾、HOTAIR lncRNA mRNA及GH檢測、細(xì)胞侵襲力觀察 ①GH3細(xì)胞的HOTAIR lncRNA表達(dá)干擾：GH3細(xì)胞疏松貼壁培養(yǎng)于無酚紅的、含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期GH3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將GH3細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、陰性對照組和HOTAIR lncRNA siRNA組：對照組不作特殊處理，陰性對照組轉(zhuǎn)染對照siRNA質(zhì)粒，HOTAIR lncRNA siRNA組轉(zhuǎn)染HOTAIR lncRNA siRNA質(zhì)粒后，培養(yǎng)72 h。陰性對照siRNA的引物序列：正向(5′-3′)為UUCUCCGAACGUGCACGUTT，反向(5′-3′)為ACGUGACACGUUCGGAGAATT；特異性抑制HOTAIR lncRNA 的siRNA引物序列：正向(5′-3′)為AAAUCCAGAACCCUCUGACAUUUGC，反向(5′-3′)為UUAAGUCUAGGAAGCACGAAGC。②各組GH3細(xì)胞的HOTAIR lncRNA mRNA檢測：方法同“1.3”。③各組GH3細(xì)胞培養(yǎng)液中生長激素檢測：采用 Growth Hormone ELISA Kit (Abcam, ab108643)。按說明書設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL和待測樣本10 μL+稀釋液40 μL，每孔各加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL，空白孔不加。水浴，洗板，加底物(A、B各50 μL)，37 ℃避光孵育。加入終止液50 μL，孵育15 min，在450 nm波長處測定各孔的光密度(OD)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本GH的濃度。④各組GH3細(xì)胞侵襲力觀察：采用 Transwell小室實(shí)驗(yàn)。收集陰性對照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的細(xì)胞，消化后重懸于無血清培養(yǎng)基，制成5×104/mL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按每孔100 μL接種于預(yù)鋪基質(zhì)膠的8μm膜的Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，PBS清洗， 5%戊二醛固定，0.01%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)5個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)(穿膜細(xì)胞數(shù)越少代表細(xì)胞侵襲力越小)，每組細(xì)胞設(shè)立3個平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 垂體生長激素腺瘤組織和正常垂體前葉組織中的HOTAIR lncRNA mRNA表達(dá)比較 非侵襲性和侵襲性垂體生長激素腺瘤及正常垂體前葉組織中的HOTAIR lncRNA相對表達(dá)量分別為1.60±0.25、 3.27±0.57、1.00±0.00；非侵襲性和侵襲性垂體生長激素腺瘤組織中的HOTAIR lncRNA相對表達(dá)量與正常垂體組織相比，P均<0.05；侵襲性垂體生長激素腺瘤組織中的HOTAIR lncRNA相對表達(dá)量與非侵襲性生長激素腺相比，P<0.01。17例侵襲性垂體生長激素腺瘤患者瘤組織中HOTAIR lncRNA mRNA高表達(dá)13例、低表達(dá)4例，34例非侵襲性垂體生長激素腺瘤患者瘤組織中HOTAIR lncRNA mRNA高表達(dá)10例、低表達(dá)24例，兩者相比，P<0.01。

2.2 陰性對照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的GH3細(xì)胞HOTAIR lncRNA mRNA、生長激素表達(dá)量、細(xì)胞侵襲力比較 陰性對照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的HOTAIR lncRNA mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.50±0.20，兩組相比，P<0.01。陰性對照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的生長激素表達(dá)量分別為(1.00±0.00)ng/mL、(0.64±0.15)ng/mL，兩組相比，P<0.05。陰性對照組、HOTAIR lncRNA siRNA組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(177±11)、(57±9)個/視野，兩組相比，P<0.05。

3 討論

垂體生長激素腺瘤是緩慢進(jìn)展的疾病, 但往往可造成多器官功能損害，在人群中總發(fā)病率約70/100萬，每年新發(fā)病例約2/100萬[12]。由于垂體生長激素腺瘤生長隱匿、發(fā)展緩慢，在患病 4～10 a才能確診，多診斷為大腺瘤和侵襲性腺瘤。侵襲性垂體生長激素腺瘤因侵襲海綿竇、頸內(nèi)動脈、下丘腦等重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)風(fēng)險極大，根治性手術(shù)難以實(shí)施，且術(shù)后易復(fù)發(fā)[13]。因此，侵襲性垂體生長激素腺瘤是臨床治療的難點(diǎn)。lncRNA的發(fā)現(xiàn)和功能學(xué)研究為腫瘤發(fā)病機(jī)制的探索提供了新的線索，也成為潛在的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。HOTAIR lncRNA是首個被發(fā)現(xiàn)以反轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)的lncRNA，長度為2 185 nt，位于12號染色體HOXC11與HOXC12之間。盡管HOTAIR基因序列保守性差，且同源間存在較大差異，但發(fā)揮生物學(xué)功能的區(qū)段的基因序列和結(jié)構(gòu)高度保守，可通過結(jié)合多梳蛋白調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。2010年Gupta等[14]首次發(fā)現(xiàn)HOTAIR lncRNA在乳腺癌腫瘤組織及其轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)水平較癌旁組織顯著增高，且在轉(zhuǎn)移灶組織中普遍偏高，多因素分析顯示HOTAIR lncRNA高表達(dá)是預(yù)測患者轉(zhuǎn)移及高死亡率的獨(dú)立危險因素之一。Li等[15]在喉鱗狀細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的HOTAIR lncRNA顯著高于癌旁組織，且可作為一個獨(dú)立的預(yù)后因素和潛在的治療靶點(diǎn)。Yang等[16]對肝癌中HOTAIR lncRNA的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)肝癌組織HOTAIR lncRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體外研究也證實(shí)，下調(diào)HOTAIR lncRNA表達(dá)可顯著提高腫瘤細(xì)胞對順鉑或柔比多星的敏感性，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示HOTAIR lncRNA可作為肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個潛在治療靶點(diǎn)。Kogo等[17]在結(jié)直腸腫瘤中也進(jìn)行了類似研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的HOTAIR lncRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后呈正相關(guān)，多因素分析也說明HOTAIR lncRNA是患者生存期的獨(dú)立的危險預(yù)測因子。此外， HOTAIR lncRNA的高表達(dá)亦可顯著提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Gupta等[14]在體外研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HOTAIR lncRNA顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性，而下調(diào)HOTAIR lncRNA表達(dá)則有效降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Geng等[18]研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，肝癌組織中HOTAIR lncRNA的表達(dá)水平顯著升高，且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性，提示HOTAIR lncRNA可作為肝癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測因素。Nakagawa等[19]研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者中，與原發(fā)性癌組織相比，腦轉(zhuǎn)移瘤組織中的HOTAIR lncRNA表達(dá)水平更高，且體外研究證實(shí)HOTAIR lncRNA高表達(dá)可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞遷移。Niinuma等[20]發(fā)現(xiàn)HOTAIR lncRNA高表達(dá)與胃腸間質(zhì)瘤患者的高風(fēng)險等級及腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲能力密切相關(guān)，體外研究也證實(shí)下調(diào)HOTAIR lncRNA表達(dá)則可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Kim等[21]同樣發(fā)現(xiàn)HOTAIR lncRNA在胰腺癌細(xì)胞侵襲方面起著重要作用。

Gupta等[14]和Shi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR與多梳蛋白抑制復(fù)合物(Polycomb repressive complex 2，PRC2)結(jié)合后作用于靶基因(包括JAM2、PCDH10等多個已知的抑癌基因)，導(dǎo)致H3組蛋白第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)和H3組蛋白第4位賴氨酸二甲基化(H3K4me2)，使該位點(diǎn)的堿基發(fā)生表觀遺傳學(xué)沉默，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

在垂體瘤研究中，Li等[23]研究表明HOTAIR lncRNA的表達(dá)或與無功能垂體腺瘤的發(fā)展與侵襲有關(guān)。李九洲等[24]也指出下調(diào)內(nèi)源性HOTAIR lncRNA的表達(dá)可有效地增強(qiáng)替莫唑胺引起的垂體腺瘤細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，本研究就HOTAIR lncRNA對垂體生長激素腺瘤侵襲和激素分泌的影響進(jìn)行了進(jìn)一步的探索，結(jié)果表明HOTAIR lncRNA在垂體生長激素腺瘤的表達(dá)水平較正常垂體前葉明顯增加，且侵襲性垂體生長激素腺瘤中的表達(dá)量較非侵襲性垂體生長激素腺瘤明顯增加。由此推測HOTAIR lncRNA的高表達(dá)與垂體生長激素腺瘤的侵襲性密切相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)HOTAIRlncRNA siRNA轉(zhuǎn)染的GH3細(xì)胞GH分泌水平和腫瘤細(xì)胞侵襲性較陰性對照組顯著下降，由此推測HOTAIR lncRNA表達(dá)上調(diào)或可導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)缺失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤分泌功能和侵襲性增強(qiáng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)垂體生長激素腺瘤組織中HOTAIR lncRNA mRNA表達(dá)異常，且該表達(dá)異常與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，提示HOTAIR lncRNA可作為識別侵襲性垂體生長激素腺瘤的新指標(biāo)。在垂體瘤GH3細(xì)胞中，抑制HOTAIR lncRNA的表達(dá)可降低GH3細(xì)胞的侵襲性和GH分泌能力，但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。推測HOTAIR lncRNA可能是垂體生長激素腺瘤GH分泌水平和腫瘤細(xì)胞侵襲性的重要調(diào)控因素，隨著對HOTAIR lncRNA功能研究的不斷深入，其有望成為垂體生長激素腺瘤的治療新靶點(diǎn)。