基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合中作用的研究進(jìn)展

馮潔，農(nóng)曉琳

(廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧530021)

皮膚創(chuàng)面愈合功能受損是糖尿病并發(fā)癥之一，15%～25%的糖尿病患者會(huì)發(fā)生糖尿病足潰瘍(DFU)，長(zhǎng)期不愈合者有高度截肢甚至死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]。正常皮膚創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜且涉及高度精細(xì)事件的過程，包括止血、炎癥反應(yīng)、增殖、肉芽組織形成、再上皮化、血管生成以及基質(zhì)重塑。該過程中形成細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)傷口中細(xì)胞黏附、遷移和組織重塑等過程。創(chuàng)面愈合過程需要降解細(xì)胞外基質(zhì)來控制，因此細(xì)胞外基質(zhì)形成與降解過程之間的不平衡可能導(dǎo)致慢性潰瘍不愈?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)屬于Zn2+依賴金屬蛋白酶超家族，能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與創(chuàng)面愈合，炎癥期消除損傷的蛋白質(zhì)和暫時(shí)性細(xì)胞外基質(zhì)，在血管生成和細(xì)胞遷移的增殖期分解毛細(xì)血管基底膜，重塑期時(shí)能收縮和重塑組織；參與創(chuàng)面愈合中與免疫相關(guān)的控制過程、細(xì)胞遷移、血管生成，并通過作用于各種細(xì)胞外效應(yīng)蛋白發(fā)揮作用，包括細(xì)胞因子、趨化因子、抗微生物肽、各種細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、甚至一些細(xì)胞外基質(zhì)成分[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是MMPs的特異性抑制物，通過調(diào)節(jié)MMPs水平來調(diào)節(jié)其活性，能夠結(jié)合并可逆性阻斷MMPs活性。糖尿病皮膚創(chuàng)面難以愈合與MMPs和TIMPs的不平衡有關(guān)[3，4]。現(xiàn)將MMPs與TIMPs在糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合過程中的作用綜述如下。

1 MMPs與TIMPs的分類

MMPs根據(jù)其底物特異性和細(xì)胞定位，可分為以下類型：①膠原酶：MMP-1、MMP-8、MMP-13及MMP-18；②明膠酶：MMP-2和MMP-9，催化域內(nèi)有纖連蛋白Ⅱ型基序，使其能夠結(jié)合并降解明膠、膠原等；③間充質(zhì)溶解素類：MMP-3、MMP-10和MMP-11；④MT-MMPs：MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24和MMP-25；⑤基質(zhì)溶解素類：MMP-7、MMP-26，均沒有與血紅素結(jié)合蛋白序列；⑥其他：MMP-11、MMP-12、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP23A、MMP23B、MMP-27和MMP-28。TIMPs目前有四種亞型，TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。

2 MMPs在糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合中的作用

2.1 膠原酶 在各種細(xì)胞培養(yǎng)和體外皮膚模型中，Ⅰ型膠原的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移依賴于MMP-1。研究發(fā)現(xiàn)，人體皮膚中的MMP-1切割Ⅰ型膠原，導(dǎo)致整合素α2β1親和力減弱，減輕了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的限制從而促進(jìn)再上皮化[3]。但MMP-1過度表達(dá)不利于再上皮化，僅在創(chuàng)面遷移性上皮邊緣的基底角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)生創(chuàng)傷會(huì)迅速增加，必須減少其過度表達(dá)以有利于再上皮化。Lobmann等[5]報(bào)道，相比于非糖尿病患者，DFU患者M(jìn)MP-1高65倍，其機(jī)制可能是由于高蛋白水解環(huán)境導(dǎo)致糖尿病患者皮膚創(chuàng)面愈合不良。還有研究表明，與健康皮膚相比，1型糖尿病DFU角質(zhì)形成細(xì)胞中MMP-1表達(dá)增加[6]。

MMP-8能有效切割Ⅰ型膠原，主要由中性粒細(xì)胞表達(dá)和儲(chǔ)存。一旦發(fā)生炎癥，中性粒細(xì)胞會(huì)滲透到組織中釋放和活化MMP-8[7]。Gooyit等[8]合成MMP-8抑制劑化合物21選擇性靶向抑制膠原酶MMP-8和MMP-12，結(jié)果顯示，db/db糖尿病小鼠與對(duì)照組相比創(chuàng)面延遲愈合，再上皮化減少，細(xì)胞凋亡增加，表明MMP-8在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮有利的作用。MMP-8在正常創(chuàng)面愈合中具有關(guān)鍵作用，但蛋白質(zhì)的過度表達(dá)可能引起膠原過度分解、中性粒細(xì)胞延長(zhǎng)炎癥期，從而導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合。在慢性愈合創(chuàng)面中可檢測(cè)到MMP-8活性和水平增加。研究發(fā)現(xiàn)，相比于非糖尿病患者，DFU患者M(jìn)MP-8明顯升高[6]。Chang[4]報(bào)道，在db/db糖尿病小鼠的創(chuàng)面中鑒定出活性MMP-8，與非糖尿病小鼠相比，db/db小鼠創(chuàng)面中活性MMP-8水平上調(diào)。

MMP-12能夠降解Ⅰ型膠原。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-12敲除小鼠的成纖維細(xì)胞形成減少，創(chuàng)面收縮減小，與對(duì)照組相比，成纖維細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化降低，表明MMP-13影響創(chuàng)面愈合中角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移、血管生成和收縮[9]。Ahmed等[10]建立糖尿病大鼠肌腱損傷模型，發(fā)現(xiàn)與糖尿病大鼠未受損肌腱相比，損傷肌腱中MMP-13表達(dá)增加，且愈合組織的血管細(xì)胞周圍觀察到MMP-13免疫反應(yīng)性增加。Pincus等[11]建立雌激素缺乏的糖尿病創(chuàng)面模型，發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用17β-雌二醇治療后MMP-13活性降低，創(chuàng)面愈合加速。

2.2 明膠酶 MMP-9能影響角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和上皮再生，在糖尿病損傷組織中表達(dá)增高，大量研究表明，過量的MMP-9是糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合不良的預(yù)測(cè)因素[4，6，12，13]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，傷口中的巨噬細(xì)胞分泌一些炎癥調(diào)節(jié)劑作用于感染性刺激物，如IL-1β、TNF-α和IL-6，這些細(xì)胞因子均與MMP-9的活性有關(guān)[14]。Gooyit等[8]合成選擇性MMP-9抑制劑，發(fā)現(xiàn)MMP-9抑制劑局部治療db/db糖尿病小鼠創(chuàng)面，與對(duì)照相比愈合加速，再上皮化增多，細(xì)胞凋亡顯著減少，證實(shí)MMP-9活性升高導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合，使用選擇性MMP-9抑制劑有望干預(yù)治療糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合。Singh等[15]研究表明，MMP-9基因表達(dá)異常是難愈性糖尿病性潰瘍的原因之一，與對(duì)照相比，糖尿病創(chuàng)面具有顯著的非甲基化MMP-9基因啟動(dòng)子狀態(tài)，這可能是MMPs表達(dá)受損的結(jié)果。Li等[1]發(fā)現(xiàn)，DFU患者受損皮膚中的MMP-9水平高于健康患者和糖尿病患者的健康皮膚，且MMP-9上調(diào)程度與定植細(xì)菌數(shù)呈正相關(guān)，認(rèn)為MMP-9在糖尿病創(chuàng)面中的上調(diào)和活動(dòng)可能是高葡萄糖和晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)。Guillemin等[16]使用殼聚糖及硫酸軟骨素溶液加入Ⅰ型膠原制成的基質(zhì)GBT013敷料作用于糖尿病小鼠慢性傷口模型，能夠降低MMP-9酶活性，改善糖尿病創(chuàng)面愈合。Henshaw等[17]在DFU局部應(yīng)用蜂膠6周，與對(duì)照組相比，蜂膠組潰瘍面積減少，清創(chuàng)傷口處MMP-9降低，提示蜂膠能下調(diào)MMP-9，減少炎癥，改善糖尿病創(chuàng)面愈合。

MMP-2在糖尿病損傷中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可增加血管細(xì)胞中MMP-2活性，刺激細(xì)胞外基質(zhì)降解并在糖尿病中引起失衡[5]。Krisp等[13]使用多維蛋白鑒定技術(shù)研究慢性DFU滲出物，發(fā)現(xiàn)MMP-2增高，對(duì)降解膠原蛋白和組織破壞具有顯著影響。Guillemin等[16]使用敷料GBT013作用于糖尿病小鼠慢性創(chuàng)面模型，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制體外MMP-2酶活性，防止生長(zhǎng)因子降解，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。

2.3 間充質(zhì)溶解素類 MMP-3參與組織重塑，可能降解膠原原纖維，并激活其他MMPs，如MMP-1、MMP-7和MMP-9。已有研究發(fā)現(xiàn)，與受傷健康大鼠相比，糖尿病大鼠受損肌腱中MMP-3基因表達(dá)下調(diào)，提示MMPs表達(dá)改變影響基質(zhì)蛋白降解和組織重塑，指出MMPs調(diào)節(jié)治療可能是糖尿病手術(shù)傷口新的再生愈合方法[10]。

MMP-10在體外可以降解彈性蛋白、非原纖維膠原蛋白、蛋白聚糖、明膠和酪蛋白，在創(chuàng)面邊緣表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格調(diào)節(jié)MMP-10表達(dá)水平是創(chuàng)面部位基質(zhì)降解的先決條件，進(jìn)而控制角質(zhì)形成細(xì)胞遷移[18]。López-López等[6]體外觀察到維生素D介導(dǎo)的DFU源角化細(xì)胞中MMP-10表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為MMP-10下調(diào)有助于糖尿病創(chuàng)面組織重建修復(fù)。

MMP-11常表達(dá)于皮膚創(chuàng)面愈合和基底細(xì)胞癌間質(zhì)中。Hattori等[19]報(bào)道，松弛素能改善糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，其機(jī)制是通過增強(qiáng)MMP-11表達(dá)，促進(jìn)調(diào)節(jié)膠原合成，減少愈合中不受控制的纖維化，維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。

2.4 膜型MMPs MMP-14位于細(xì)胞表面，切割細(xì)胞周圍的膠原纖維[20]，對(duì)創(chuàng)面愈合的生理病理過程至關(guān)重要。成纖維細(xì)胞中的MMP-14表達(dá)在成人皮膚膠原重塑中起關(guān)鍵作用，有助于纖維化皮膚病中真皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)[21]。MMP-14還能與proMMP-2和TIMP-2形成復(fù)合物，激活MMP-2，復(fù)合物成分比例的任何變化可能導(dǎo)致基質(zhì)降解變化。另外，MMP-14激活MMP-13，通過降解產(chǎn)生的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合、血管生成和炎癥反應(yīng)。Pincus等[11]局部應(yīng)用17β-雌二醇治療雌激素缺乏的糖尿病創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)MMP-14活性降低，MMP-14表達(dá)降低不僅調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-13活性，也減少基質(zhì)降解，增加膠原含量，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

2.5 基質(zhì)溶解素類 MMP-26能切割纖連蛋白、玻連蛋白、纖維蛋白原、Ⅳ型膠原、明膠、α2-巨球蛋白和α1-蛋白酶抑制劑，還可激活proMMP-9，促進(jìn)切割蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-26在創(chuàng)面愈合的角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[22]。Piril?等[7]報(bào)道，慢性糖尿病創(chuàng)面中，MMP-26在上皮基底膜區(qū)域下方及皮下神經(jīng)處都有表達(dá)，經(jīng)過體外口腔黏膜角化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，提示MMP-26對(duì)正常細(xì)胞遷移非常重要。但由于MMP-26在嚙齒動(dòng)物中無法表達(dá)，還需人類標(biāo)本進(jìn)行更多病理生理學(xué)研究，探索MMP-26的作用機(jī)制。

3 TIMPs在糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合中的作用

TIMP-1可在切除傷口和人類燒傷部位上皮細(xì)胞中檢測(cè)到，在傷口成纖維細(xì)胞尤其是血管周圍發(fā)生轉(zhuǎn)錄。Lao等[23]發(fā)現(xiàn)，糖尿病皮膚組織和糖基化終末產(chǎn)物處理的人成纖維細(xì)胞中TIMP-1的表達(dá)均顯著降低，采用活性蛋白TIMP-1處理人成纖維細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)活性蛋白TIMP-1有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，減少細(xì)胞凋亡；采用TIMP-1載體介導(dǎo)基因治療糖尿病大鼠創(chuàng)面后，觀察到愈合明顯改善，提示TIMP-1促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。Ambrosch等[24]對(duì)8例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染患者的糖尿病足進(jìn)行達(dá)托霉素抗感染治療，發(fā)現(xiàn)14 d后創(chuàng)面TIMP-1表達(dá)增加，創(chuàng)面面積收縮，提示達(dá)托霉素抗感染治療可通過增加TIMP-1表達(dá)促進(jìn)愈合。Ayuk等[25]采用660或830 nm激光照射體外培養(yǎng)的糖尿病患者皮膚成纖維細(xì)胞，8 h后發(fā)現(xiàn)TIMP-1表達(dá)增加，提示激光照射可增加TIMP-1表達(dá)，減少基質(zhì)降解，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。Guillemin等[16]使用GBT013敷料提高糖尿病小鼠慢性創(chuàng)面中TIMP-1的表達(dá)，有助于創(chuàng)面愈合中組織重塑。

4 MMPs/TIMPs比值與糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合的關(guān)系

MMP-9是正常創(chuàng)傷愈合過程中的主要膠原酶，其過度表達(dá)和激活可能導(dǎo)致糖尿病慢性難愈合性下肢潰瘍。TIMP-1可結(jié)合并抑制MMP-9活性，MMP-9/TIMP-1平衡影響著DFU創(chuàng)面愈合。過高的MMP-9/TIMP-1比值與DFU的潰瘍愈合及創(chuàng)面閉合率呈負(fù)相關(guān)[7]。Li等[26]報(bào)道，MMP-9/TIMP-1比值過高提示創(chuàng)面愈合不良，MMP-9/TIMP-1比值可作為入院治療前評(píng)估糖尿病創(chuàng)面愈合情況的預(yù)測(cè)指標(biāo)。另外，Li等[1]對(duì)32例糖尿病患者DFU取皮膚活檢并行微生物培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MMP-9/TIMP-1比值升高，VEGF表達(dá)降低，表明MMP-9/TIMP-1比值過高可能通過降低VEGF表達(dá)抑制糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合；同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)，感染的DFU組TIMP-1表達(dá)降低，其原因可能是由于高葡萄糖條件下，成纖維細(xì)胞減少TIMP-1表達(dá)、增加MMP-9表達(dá)，此外細(xì)菌可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子如IL-4和IL-6分泌，其過度活化可以減少TIMP-1。

MMPs及TIMPs在糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合中的作用十分復(fù)雜，盡管有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但由于蛋白酶家族過多成員及補(bǔ)償機(jī)制，至今尚未完全闡明它們的影響機(jī)制。全面分析MMPs及TIMPs在糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合發(fā)生發(fā)展中的進(jìn)展機(jī)制，對(duì)于臨床模擬MMPs抑制劑作用控制相關(guān)MMPs及細(xì)胞因子改善創(chuàng)面愈合有重要意義。