海蘭褐蛋雞Ⅰ群禽腺病毒與球蟲(chóng)混感的病例診斷

向大育，申紅春

（恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院 445000）

2017年5月，恩施自治州某規(guī)?；u場(chǎng)45日齡左右的海蘭褐蛋雞群開(kāi)始出現(xiàn)死亡，表現(xiàn)為零星死亡，隨后死亡增加，日死亡率達(dá)2%，病雞精神沉郁，食欲差，雞冠蒼白，排拉紅色血便。采用雙黃連口服液和地克珠利治療，治療效果不佳。該雞場(chǎng)將患病蛋雞送檢恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院，剖檢見(jiàn)心包積液嚴(yán)重，肝臟黃黑相間。腎臟腫大、蒼白，有尿酸鹽沉積，盲腸內(nèi)充滿(mǎn)血液。

根據(jù)該雞群的發(fā)病史、臨床癥狀和剖檢變化，初步診斷疑似為球蟲(chóng)與禽腺病毒I群混合感染。為了進(jìn)一步確診，對(duì)送檢患病蛋雞進(jìn)行了糞檢、PCR檢測(cè)和病毒分離等實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來(lái)源于恩施某雞場(chǎng)的患病雞，無(wú)菌剖檢采集肝臟、心包積液等組織，加入的無(wú)菌PBS溶液，研磨后，-20℃保存；糞便采集新鮮血便。

1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA凝膠回收試劑盒等材料購(gòu)自上海生工工程股份有限公司（簡(jiǎn)稱(chēng)上海生工）。

1.3 儀器

PCR儀：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；顯微鏡：奧林巴斯（中國(guó)）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 糞便蟲(chóng)卵檢查

取患病雞新鮮糞便適量，加入飽和食鹽水50mL，攪拌后使用60目篩網(wǎng)過(guò)濾。將過(guò)濾液按照3000r/min離心10min，棄上清液，沉渣再加50mL飽和食鹽水，靜置25min，蘸取表層液體置于載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢。

1.4.2 病毒的檢測(cè)

無(wú)菌采集病死蛋雞的心包積液和肝臟，并提取組織總DNA和總RNA。以其為模板，分別進(jìn)行FAdV-Ⅰ的常規(guī)PCR和RTPCR擴(kuò)增。

禽腺病毒特異性引物參照文獻(xiàn)中Ⅰ亞群的禽腺病毒Hexon基因合成引物，擴(kuò)增片段為500bp，上游引物F：5'-AATTTCGACCCCATGACGCGCCCAGG-3'，下游引物R：5'-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3'。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)引物均由上海生工合成。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送上海生工測(cè)定基因序列。

2 結(jié)果

2.1 病雞的眼觀病變

患病蛋雞心包積液嚴(yán)重，心包中可見(jiàn)到大量的淡黃色的清亮液體，肝臟腫大，出血，質(zhì)地脆弱易破裂，表面凹凸不平，壞死灶和出血交替出現(xiàn)，呈現(xiàn)黃黑相間。腎臟腫大、蒼白，有尿酸鹽沉積，盲腸內(nèi)充滿(mǎn)血液。

2.2 糞便鏡檢結(jié)果

鏡檢可見(jiàn)一端稍尖，另一病料樣品孔與心包中液體端鈍圓呈現(xiàn)橢圓形或卵圓形的球蟲(chóng)卵囊。

2.3 病毒的檢測(cè)及測(cè)序分析

PCR電泳試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中可以看出，本次試驗(yàn)病料樣品與心包積液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小相符，試驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶處于508bp，基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列比對(duì)，并用DNAStar軟件同源性分析，結(jié)果為，分離株與禽腺病毒I群序列同源性為96.5%，表明病料樣品中含有禽腺病毒I群。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DL1 000 DNA Marker；1：組織樣品；2：心包積液；3：陽(yáng)性對(duì)照；4：陰性對(duì)照

3 討論

禽腺病毒I群主要引起雞的包涵體肝炎、心包積水綜合征的特異性病原體，其主要病變特征為心包中有淡黃色水樣或膠凍樣的積液，心臟松弛、柔軟。肝臟呈現(xiàn)淡褐色和黃色，質(zhì)地變脆，出現(xiàn)充血、腫脹，伴有局灶性壞死點(diǎn)和出血點(diǎn)[1]。根據(jù)雞群的臨床癥狀、發(fā)病和病變特點(diǎn)、PCR檢測(cè)及目的基因測(cè)序結(jié)果，可以確診該雞群為FAdV-Ⅰ與球蟲(chóng)混合感染。

心包積液綜合征首次發(fā)生于1987年的巴基斯坦安卡拉地區(qū)[2]，我國(guó)的相關(guān)心包積液綜合征報(bào)道較少。自2015年以來(lái)我國(guó)河南、遼寧、吉林、山東、河北陸續(xù)出現(xiàn)類(lèi)似的疾病，并且呈現(xiàn)普發(fā)態(tài)勢(shì)，已經(jīng)為嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的一種傳染病[2]。當(dāng)前有學(xué)者對(duì)湖北各地區(qū)雞場(chǎng)中禽腺病毒I群感染進(jìn)行報(bào)道，郭杰、羅玲分別從湖北省某雞場(chǎng)中心包積液綜合征病例中分離鑒定為禽腺病毒I群[3]；周偉、鄭成分別從武漢周邊發(fā)病雞場(chǎng)中分離出禽腺病毒I群[4]；蔡宇威報(bào)道從仙桃市某發(fā)病雞場(chǎng)分離出禽腺病毒I群[4]。而恩施自治州尚未見(jiàn)該病的報(bào)道，本次從恩施某雞場(chǎng)的獲得分離株與禽腺病毒I群序列同源性為96.5%，表明在恩施地區(qū)該疾病已經(jīng)流行。

此外，文獻(xiàn)報(bào)道禽腺病毒I群一個(gè)條件致病性病毒，廣泛存在于家禽的呼吸道和消化道，其發(fā)病往往伴隨著其他不良因素如通風(fēng)不良、飼料霉菌毒素超標(biāo)；或者其他疾病如IBD、CIAV、H9N2、NDV的發(fā)生。因此，在飼養(yǎng)過(guò)程中要注重家禽飼養(yǎng)管理，提高雞體免疫功能，同時(shí)加強(qiáng)禽舍中的環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)通風(fēng)，合理消毒，并做好IBD、CIAV等疾病的免疫工作，減少心包積液綜合征。在治療過(guò)程中，使用卵黃抗體，并結(jié)合保肝護(hù)腎的藥物進(jìn)行治療，減少家禽的死亡，降低養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失。