熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核診斷中的應(yīng)用探討

譚珂 孫炳奇 沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院（沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院）結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室 （遼寧 沈陽(yáng) 110044）

結(jié)核屬于臨床常見(jiàn)疾病，結(jié)核分枝桿菌屬于主要病原菌，其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)當(dāng)屬診斷結(jié)核病及治療轉(zhuǎn)歸比較重要的依據(jù)[1]。盡量提高檢測(cè)水平，促進(jìn)早診斷與早治療，是有效控制結(jié)核病蔓延的主要方案[2]。細(xì)菌培養(yǎng)與涂片鏡檢是最為主要的實(shí)驗(yàn)室診斷方案，從有關(guān)研究報(bào)告中可以看出，傳統(tǒng)培養(yǎng)方式周期過(guò)長(zhǎng)，檢出率較低[3]，無(wú)法滿足臨床需求。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)主要是利用PCR體外擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA，是比較重要的一種基因診斷方法，有著特異性好、靈敏度高、污染少等特點(diǎn)[4]。為了進(jìn)一步探討結(jié)核診斷中應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的價(jià)值，本院將收治的120例結(jié)核患者進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

本次研究共有對(duì)象120例納入，全部是本院收治的結(jié)核患者，納入時(shí)間2013年12月～2015年9月。120例患者中男性有73例、女性有47例；年齡20～83歲，平均（57.9±15.4）歲。所有患者臨床資料完整，根據(jù)診察需要，收集患者痰液、胸腹水、尿液等標(biāo)本進(jìn)行處理。

1.2 方法

所有患者標(biāo)本均進(jìn)行涂片查找抗酸桿菌，以及結(jié)核菌培養(yǎng)、結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)等處理，根據(jù)涂片結(jié)果分為兩組，其中涂陽(yáng)結(jié)核30例為涂陽(yáng)組，涂陰結(jié)核90例為涂陰組。針對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性者再次進(jìn)行耐藥基因測(cè)定，涂陽(yáng)組且結(jié)核分枝桿菌DNA陰性則實(shí)施非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)涂陽(yáng)組與涂陰組檢驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性率進(jìn)行記錄與對(duì)比，同時(shí)觀察記錄結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性中耐藥情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次研究數(shù)據(jù)利用SPSS19.0分析，計(jì)數(shù)資料采取百分比（%）表示與χ2檢驗(yàn)，將P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2.結(jié)果

2.1 涂陽(yáng)組與涂陰組結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性率、結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性率比較

涂陽(yáng)組結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性率、結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性率均顯著高于涂陰組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1. 涂陽(yáng)組與涂陰組結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性率、結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性率對(duì)比(n,%)

2.2 結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性者耐藥菌情況

結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性者64例，最終檢出耐藥7例，耐藥率為26.56%，見(jiàn)表2。

表2. 結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性耐藥情況分析

3.討論

結(jié)核屬于常見(jiàn)疾病，主要是結(jié)核分枝桿菌感染所致，也是威脅人類生命健康最為主要的疾病之一。結(jié)核分枝桿菌傳染源主要為排菌肺核患者，主要經(jīng)呼吸道傳播，健康人群感染后并不一定發(fā)病，但機(jī)體免疫力下降后則容易發(fā)病。從WHO相關(guān)統(tǒng)計(jì)報(bào)告中可以看出，全球每年結(jié)核病發(fā)生大約有800～1000萬(wàn)，且每年死于結(jié)核病的人次高達(dá)300萬(wàn)，是造成患者死亡最為主要的傳染病。1993年WHO宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”，將其作為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，而我國(guó)屬于結(jié)核病疫情最為嚴(yán)重的一個(gè)國(guó)家，需積極做好預(yù)防與治療。結(jié)核診斷方式以結(jié)核病原學(xué)檢測(cè)為主，該方法是發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌主要途徑，方法較多，比如涂片查找抗酸桿菌、結(jié)核菌培養(yǎng)、結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)等。

本院將收治的120例結(jié)核患者作為對(duì)象進(jìn)行研究，均接受結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)與結(jié)核菌培養(yǎng)及涂片查找抗酸桿菌，根據(jù)涂片查找抗酸桿菌結(jié)果分為兩組，涂陽(yáng)結(jié)核為涂陽(yáng)組，涂陰結(jié)核為涂陰組，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性者再次耐藥基因測(cè)定，涂陽(yáng)組且結(jié)核分枝桿菌DNA陰性則再次實(shí)施非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定，結(jié)果顯示涂陽(yáng)組結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性率、結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為93.33%、86.67%，涂陰組則依次為40.00%、10.00%，涂陽(yáng)組均顯著高于涂陰組（P＜0.05）；結(jié)核分枝桿菌DNA陽(yáng)性中檢出耐藥株，包括單耐藥和異煙肼利福平雙重耐藥，例數(shù)分別為4例、3例。傳統(tǒng)涂片查找抗酸桿菌盡管操作性與及時(shí)性等有優(yōu)勢(shì)，但敏感性過(guò)低，且標(biāo)本濃度達(dá)到10000條/mL才能測(cè)得陽(yáng)性結(jié)果，可見(jiàn)特異性較差。近幾年，培養(yǎng)法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，有高特異性與敏感性，但4～8周才能獲得結(jié)果，檢驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)，而且對(duì)于結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌菌種還要進(jìn)一步鑒別與診斷。熒光定量PCR技術(shù)是利用一對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性引物、一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光探針，加上PCR反應(yīng)液、四種核苷酸單體、耐熱DNA聚合酶等，采取PCR擴(kuò)增法測(cè)定結(jié)核分枝桿菌DNA水平。這種技術(shù)屬于重要的基因診斷方法，不僅靈敏度高、特異性良好，而且能定量測(cè)定，污染更少，耗時(shí)更短，更標(biāo)準(zhǔn)。此外，熒光定量PCR技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，累積監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，并監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程，經(jīng)CT值、標(biāo)準(zhǔn)缺陷測(cè)定樣品DNA或者cDNA，這種方式快速、準(zhǔn)確，僅需1d便能獲得檢測(cè)結(jié)果。加上采取密閉狀態(tài)下PCR擴(kuò)增，使得擴(kuò)增物無(wú)污染，減少假陽(yáng)性結(jié)果，使得檢查特異性與靈敏度明顯提高。熒光定量PCR診斷結(jié)核分枝桿菌特異性與敏感性均較高，比抗酸涂片法更有優(yōu)勢(shì)，且和抗酸涂片陽(yáng)性程度相關(guān)性良好，聯(lián)合診斷能提高陽(yáng)性菌診斷符合率，為臨床診治提供更可靠的依據(jù)。

綜上所述，結(jié)核診斷中應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)處理，對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA有較高的敏感性，檢出率高，而且檢查時(shí)間短，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥等情況，以便為臨床治療用藥提供依據(jù)。

[1]王雅寧.熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌臨床應(yīng)用分析[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,19(9):1404-1406.

[2]周穩(wěn)蘭,陸春芬,朱蔚崗,等.熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用[J].江蘇醫(yī)藥,2015,15(23):2874-2875.

[3]鄔艷.熒光定量PCR檢測(cè)痰結(jié)核桿菌特異性DNA序列及其臨床應(yīng)用[J].中外醫(yī)學(xué)研究,2012,10(16):65-66.

[4]朱明利.熒光定量PCR對(duì)血及痰培養(yǎng)物中結(jié)核分枝桿菌DNA的檢測(cè)[J].國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志,2010,37(3):145-148.