ERIC-PCR技術(shù)在動物流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用

朱佳文 ，吳永勝 ，許禎瑩 ，蘇志鵬 ，邱時秀 ，李娟 *

（1.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所，四川 溫江 611130；2.四川特驅(qū)投資集團(tuán)有限公司，四川 雙流 610207）

近幾年，越來越多的科研工作者開始專注于腸道微生物的研究，ERIC-PCR技術(shù)以其操作簡單、試驗重復(fù)性高和分辨力強(qiáng)等優(yōu)點而被廣泛利用。

1 ERIC-PCR技術(shù)的背景

ERIC是腸桿菌間保守的重復(fù)基因序列，能夠同時比較大規(guī)模微生物樣品的序列結(jié)構(gòu)特征。ERIC序列長為126bp，存在于基因組的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，其序列具有高度保守性，但在不同物種染色體上的定位不同。Hulton等[1]指出ERIC序列存在于許多腸道菌中，而且可以作為大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和其他一些腸道微生物新的重復(fù)單元家族。同年，Versalovic等[2]發(fā)現(xiàn)可以通過ERIC序列設(shè)計引物對細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同細(xì)菌基因組的指紋圖譜。由于ERICPCR技術(shù)能夠得到敏感性好和重復(fù)性高的ERICPCR指紋圖譜，因而該技術(shù)逐漸被利用在各種不同的環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中，并且取得了較好的結(jié)果。

2 ERIC-PCR檢測原理及優(yōu)缺點

ERIC-PCR原理是根據(jù)ERIC核心序列（44bp）設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Versalovic等[2]早在1991年便設(shè)計了一對反向引物（ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCT GGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGG GTGAGCG-3′），用于擴(kuò)增兩個相鄰的ERIC保守序列之間的區(qū)域，由于不同細(xì)菌基因組上ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，得到的DNA指紋圖譜也不同，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在50～3000bp之間，根據(jù)電泳帶上不同的DNA片段可以分析菌種類型。

相對于其他分子流行病學(xué)分型方法，ERIC-PCR具有操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點。ERICPCR技術(shù)能夠有效區(qū)分細(xì)菌菌株間的差異性，在流行病學(xué)調(diào)查中具有重要價值。雖然ERIC-PCR技術(shù)是一種有效的細(xì)菌基因分型方法，但仍存在不足。若想得到更好的圖譜豐度和準(zhǔn)確性則需要不斷地優(yōu)化條件或結(jié)合其他方法共同檢測。潘康成等[3]于2010年分別利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術(shù)對肉雞喂服枯草芽孢桿菌后的腸道菌群多樣性進(jìn)行研究，雖然兩種方法的結(jié)果均顯示飼喂枯草芽孢桿菌后能提高肉雞腸道微生物的豐度和種群密度，但從指紋圖譜和統(tǒng)計條帶數(shù)量上看，PCR-DGGE技術(shù)更優(yōu)于ERIC-PCR技術(shù)。

3 ERIC-PCR在動物流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用

3.1 ERIC-PCR在監(jiān)測動物腸道微生物多樣性上的應(yīng)用 動物腸道微生物在機(jī)體發(fā)育、免疫、營養(yǎng)物質(zhì)代謝和疾病發(fā)生等方面都有非常重要的作用，而ERIC-PCR作為一種快速有效的分析腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和動態(tài)平衡的分子生物學(xué)手段已有越來越廣泛的應(yīng)用。2005年，魯海峰等[4]抽提大熊貓糞便樣品中的微生物總DNA，并以此為模板進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增和Southern雜交，比較了各DNA樣品指紋圖譜的相似性指數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大熊貓不同個體間的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)比較相似，同一個體不同時期穩(wěn)定性較高，但當(dāng)個體出現(xiàn)問題時腸道優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)有一定波動。2011年，楊柳等[5]采用ERIC-PCR與DGGE相結(jié)合的方式，分析了榮昌豬腸道微生物群落特征，并與外源品種豬（長白、杜洛克）的腸道微生物群落進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)母豬哺乳對仔豬腸道微生物的影響明顯，且不同品種豬的腸道優(yōu)勢菌差異較大。2013年，崔明全等[6]分析了一只野生大熊貓和不同年齡段圈養(yǎng)大熊貓糞便菌群的多樣性和相似性，發(fā)現(xiàn)大熊貓的腸道菌群多樣性容易受到生長環(huán)境、年齡因素的影響，并指出應(yīng)用ERIC-PCR指紋圖譜優(yōu)勢條帶鑒定優(yōu)勢菌的方法有一定的局限性。孫杰等[7]采用常規(guī)菌群分析方法和ERIC-PCR技術(shù)對正常小鼠和抗生素相關(guān)性腹瀉小鼠進(jìn)行了腸道菌群的檢測，驗證了ERIC-PCR技術(shù)的準(zhǔn)確性，并發(fā)現(xiàn)陰性組和對照組腸道菌群的分布狀況存在明顯差異。

3.2 ERIC-PCR在病原菌分類上的應(yīng)用 由于ERIC-PCR得到的圖譜穩(wěn)定、重復(fù)性高，并能產(chǎn)生多種獨特的擴(kuò)增產(chǎn)物，所以可以將細(xì)菌進(jìn)行分型。1999年，Giovanni等[8]將ERIC-PCR技術(shù)應(yīng)用到混合菌群和BIOLOG革蘭氏陰性菌群的群落結(jié)構(gòu)分析上，得到了能夠反映菌群組成差異且穩(wěn)定的指紋圖譜。ERIC指紋圖譜在李斯特菌種間及單增李斯特菌株間有很好的鑒別能力[9]。李鵬等[10]根據(jù)副豬嗜血桿菌15種血清型的特異性ERIC指紋圖譜，對中國東南部不同豬場的111株副豬嗜血桿菌樣品進(jìn)行鑒定，得到了23種指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)的分離株，其ERIC指紋圖譜也不同，說明副豬嗜血桿菌在中國東南部存在多種基因型，同時驗證了ERIC-PCR技術(shù)可用于對某一地區(qū)的細(xì)菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究和基因型鑒定。

3.3 ERIC-PCR在追溯感染源上的應(yīng)用 ERIC-PCR技術(shù)在確定疫病暴發(fā)或流行，追溯傳染源和控制腸道致病菌中也有非常重要的作用。2013年，宋玉財?shù)萚11]利用ERIC-PCR技術(shù)對比健康仔豬與黃白痢仔豬的糞樣樣品圖譜，發(fā)現(xiàn)健康仔豬糞樣與黃白痢仔豬的相比，ERIC-PCR圖譜相似性高，而且黃白痢仔豬腸道菌群中至少有一種類型的細(xì)菌異常增殖，這可能是造成仔豬黃白痢的原因。朱曉慧等[12]于2016年通過ERIC-PCR擴(kuò)增比較了健康大鼠和水浸束縛應(yīng)激大鼠的腸道微生物變化，發(fā)現(xiàn)急性應(yīng)激后大鼠胃部和回腸的特征性條帶較少，而盲腸和結(jié)腸的特征性條帶較多，暗示干預(yù)急性應(yīng)激可以從盲腸和結(jié)腸入手。曾波等[13]于2017年構(gòu)建了不同周齡健康家兔及腹瀉家兔腸道微生物的ERIC-PCR指紋圖譜，分析二者腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性及其差異性，發(fā)現(xiàn)隨著家兔周齡的增加，健康家兔的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生了明顯變化；腹瀉兔與同一周齡的健康兔比較，腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多樣性降低，并出現(xiàn)了新的優(yōu)勢菌群。這些研究結(jié)果為優(yōu)化家兔飼養(yǎng)和預(yù)防疾病打下了基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

綜上所述，利用ERIC-PCR分子生物學(xué)技術(shù)追蹤腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)特征和監(jiān)測生物種群動態(tài)是一種高效簡單的手段，在流行病學(xué)調(diào)查上具有非常重要的價值。該技術(shù)可以從分子水平上對細(xì)菌群進(jìn)行快速的鑒別分類，為人類更好地了解和監(jiān)測動物腸道微生物穩(wěn)態(tài)提供有力的依據(jù)，在探討微生物和動物健康方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Hulton C S J，Higgins C F，Sharp P M.ERIC sequences：a novel family of repetitive elements in the genomes ofEscherichia coli，Salmonella typhimuriumand other enterobacteria[J].Molecular Microbiology，1991，5（4）：825-834.

[2] Versalovic J，Koeuth T，Lupski R.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J].Nucleic Acids research，1991，19（24）：6823-6831.

[3] 潘康成，陳正禮，崔恒敏，等.利用ERIC-PCR和PCRDGGE技術(shù)分析喂服枯草芽孢桿菌肉雞腸道菌群的多樣性[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2010，22（4）：985-991.

[4] 魯海峰，魏桂芳，李仲逵，等.ERIC-PCR分子雜交技術(shù)分析大熊貓腸道菌群結(jié)構(gòu)[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17（2）：81-84.

[5] 楊柳，張邑帆，鄭華，等.榮昌、長白、杜洛克豬腸道微生物ERIC-PCR-DGGE指紋圖譜比較分析[J].家畜生態(tài)學(xué)報，2011，32（5）：21-25.

[6] 崔明全，何廷美，鐘志軍，等.大熊貓糞便菌群ERICPCR指紋圖譜的分析及優(yōu)勢菌群的鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45（9）：6-11.

[7] 孫杰，孫麗妲，倫永志，等.基于ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)的小鼠腸道菌群失調(diào)分析方法的建立[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2016，28（12）：1386-1388.

[8] Di Giovanni G D，Watrud L S，Seidler R J，et al.Fingerprinting of mixed bacterial strains and BIOLOG Gram-Negative（GN） substrate communities by enterobacterialrepetitive intergenic consensus sequence-PCR（ERIC-PCR）[J].Current Microbiology，1999，38（4）：217-223.

[9] 金莉莉，王秋雨，侯瀟.ERIC-PCR技術(shù)在李斯特氏菌種、菌株鑒定中的應(yīng)用[J].遺傳，2003，25（2）：195-197.

[10] 李鵬，李軍星，李玉峰，等.中國東南部地區(qū)副豬嗜血桿菌分離株ERIC-PCR指紋圖譜分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2009，29（12）：1566-1570.

[11] 宋玉財，王彬，王俊卿，等.健康仔豬與黃白痢仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)分析[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2013，34（2）：21-22.

[12] 朱曉慧，張成崗，劉海峰.急性應(yīng)激后大鼠胃腸道病理變化及其菌群ERIC-PCR圖譜分析[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2016，6（3）：200-205.

[13] 曾波，張智，李再新.家兔腸道微生物ERIC-PCR指紋圖譜構(gòu)建及分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，48（1）：139-143.