豬偽狂犬病病毒診斷與檢測方法研究進(jìn)展

劉霞 王慧 李照偉/貴州省動物疫病預(yù)防控制中心

崔燕/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬、牛等多種家畜和野生動物的一種急性傳染病，以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主要癥狀（豬除外） 。該病主要引起種豬呼吸系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)疾病和仔豬神經(jīng)系統(tǒng)疾病，成年豬呈隱性感染，仔豬病死率100%。在世界上，已有 40多個國家發(fā)生此病，發(fā)達(dá)國家已將本病列為重點防治疾病之一；在我國，自1947年首次報道后，已有20多個省、市、自治區(qū)相繼報道過本病，2012年以來PRV的持續(xù)性感染和潛在的免疫抑制，更是給我國豬病防治和疫病凈化工作帶來了很大的困難。國外一些專家認(rèn)為，全世界由PR造成的損失每年可達(dá)幾十億美元，僅低于口蹄疫（FMD）和豬瘟(CSF)。

近年來，PR發(fā)生報道數(shù)急劇上升，目前該病尚無有效的藥物治療。疫苗接種是預(yù)防控制PR的主要措施之一，就目前來看，PR的傳統(tǒng)疫苗已經(jīng)相對成熟，但現(xiàn)代疫苗的研究尚處于研究階段。因此，提高PR的診斷技術(shù)是防控該病的先決條件，只有早發(fā)現(xiàn)、早防控才能更加有效地降低PR的發(fā)生，避免養(yǎng)豬業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟損失。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的日漸完善，相關(guān)的血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法也不斷完善。為此，本文對臨床診斷、病原學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)等主要方法的研究進(jìn)展和應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以期為PR臨床診斷與檢測技術(shù)提供參考和借鑒。

一、臨床診斷

臨床診斷就是根據(jù)流行病學(xué)特點、典型的臨床癥狀及病例剖檢等初步診斷。感染PR的病豬臨床癥狀因年齡和毒株毒力不同而有所差異。其中哺乳仔豬最為敏感，病死率可達(dá)100%，主要臨床表現(xiàn)為高熱、排稀便、嘔吐-共濟失調(diào)、四肢呈游泳狀等神經(jīng)癥狀，最后昏迷死亡；成年豬多數(shù)不表現(xiàn)臨床癥狀，或僅出現(xiàn)體溫輕微升高；懷孕母豬常發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎或死胎。

二、病原學(xué)診斷

病原學(xué)診斷主要包括三種方法，即病毒分離、病毒接種及動物感染，被稱為診斷PRV的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但存在敏感性較差的問題。病毒分離取病死豬或處于發(fā)熱期病豬的中腦、腎臟、肝、脾及扁桃體，加PBS制成10%懸液，再加雙抗，混勻，4℃過夜后2 000 r/min離心，取上清待動物感染或細(xì)胞接種使用。取處理液接種于PK-15、SK6等敏感細(xì)胞，培養(yǎng)24～72 h左右，取培養(yǎng)物進(jìn)行HE染色，鏡檢可發(fā)現(xiàn)酸性核內(nèi)包涵體；接種于家兔或小白鼠，接種后2～3 d，家兔與小白鼠均出現(xiàn)典型的劇癢癥，體溫升高，接種后 3～5 d全部死亡，即可確診，病毒尚可以在病死兔腦中分離獲得。

三、血清學(xué)方法

血清學(xué)檢測手段，尤其是研制成功的部分ELISA試劑盒操作簡單、方便，不需要使用昂貴復(fù)雜的儀器，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。目前常應(yīng)用血清學(xué)方法有瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、中和試驗（NT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和乳膠凝集試驗（LAT）。

1.瓊脂免疫擴散試驗(AGID)。瓊脂免疫擴散試驗（AGID）無需特殊設(shè)備，技術(shù)操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，因此適用于基層獸研單位和大型豬場的現(xiàn)場定性診斷及豬群隱形無感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和血清中和實驗(SNT)進(jìn)行了比較試驗，發(fā)現(xiàn)與SNT的陽性符合率為94%，可以作為一種檢測偽狂犬病和抗體水平的檢測。代明娟等(2002)利用AGID技術(shù)對5個豬場進(jìn)行了抗體檢測，結(jié)果分析表明豬場的血清陽性率為80.0%，再一次顯示了AGID技術(shù)的簡便和快捷。

2.中和試驗（NT）。中和試驗（NT）又稱微量血清中和試驗（MSNT），是檢測病毒比較經(jīng)典的方法，是世界上多數(shù)國家診斷PR的法定方法之一。NT敏感性及準(zhǔn)確性都較理想，但操作繁瑣，且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制，不適合作為流行病學(xué)調(diào)查和大批量疫控監(jiān)測使用。邱德新等應(yīng)用MSNT和偽狂犬病乳膠凝集實驗(LAT)診斷試劑盒進(jìn)行了PRV抗體效價測定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩種方法檢測結(jié)果符合率高，特異性強，LAT比MSNT敏感、快速簡便和實用。孫廣力等應(yīng)用LA T、AGID、MSNT 3種診斷方法對45份豬血清樣品進(jìn)行了PR血清杭體檢測，結(jié)果表明MSNT的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性均最為敏感。

3.乳膠凝集試驗（LA T）。乳膠試驗?zāi)囼灒↙AT）是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點，將抗原先用乳膠包被，再與相應(yīng)血清反應(yīng)，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果，具有操作簡單、方便、快速。與NT相比，LAT具有更加廣闊的推廣前景。羅勇等利用乳膠凝膠實驗技術(shù)對疑似豬瘟病的病豬進(jìn)行了豬偽狂犬病毒的檢測，230份血清中陽性率11%。近年，美國已經(jīng)有商品化的LAT試劑盒供臨床使用。國內(nèi)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)也成功研制了gGLAT和gELAT試劑盒。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是目前最為廣泛應(yīng)用的一種免疫檢測方法，被OIE定為診斷PR的首選血清學(xué)方法。它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固體載體上，隨后的一系列免疫學(xué)和酶促生化反應(yīng)都在此固相載體上進(jìn)行的免疫酶測定實驗，具有特異、敏感、快速、簡便的優(yōu)點，適用于實驗室大批量樣品的檢測、產(chǎn)地檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等。國內(nèi)蔣玉雯等(1988)建立了檢測偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認(rèn)為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學(xué)調(diào)查。隨著基因工程缺失疫苗的研制成功，我國唐勇、羅飛等學(xué)者又陸續(xù)建立了可以鑒別診斷野毒株和疫苗毒株、敏感性和特異性更高的ELISA方法。

四、分子生物學(xué)技術(shù)

1.核酸探針。在多種診斷偽狂犬病的方法中，核酸探針技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)探針技術(shù)。它具有特異性良好、敏感程度高的優(yōu)點，被廣泛用于PRV的診斷和檢測中。Maes等用生物素和地高辛標(biāo)記的探針從三叉神經(jīng)節(jié)診斷出PRV DNA，并進(jìn)行了原位雜交，從單細(xì)胞的水平上檢出存在的潛伏感染。在國內(nèi)，郭萬柱等采用32P探針標(biāo)記PRV全基因組和重組質(zhì)粒應(yīng)用斑點雜交技術(shù)，能檢測出10pg的PRV DNA，并具有較高的特異性。王琴等、魏偉等相繼以非放射性生物素和光敏生物素標(biāo)記DNA探針，均能有效地檢測出PRV DNA。2008年，劉志杰等制備了地高辛標(biāo)記的gE基因核酸探針，對PRV野毒的最低檢出量為4pg，與PCR檢測結(jié)果一致，表明該核酸探針可用于PR野毒感染的臨床診斷。

2.PCR方法。（1）常規(guī)PCR方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）因其快速、特異、敏感、安全可靠等明顯優(yōu)勢，在檢測PRV方面得到了廣泛應(yīng)用。目前，PRV檢測的基因片段主要有g(shù)B、gD、gG和gE等，其中g(shù)D基因是主要中和抗原基因。我國周復(fù)春等應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行了PRV的檢測，并對潛伏的感染部位也進(jìn)行了相應(yīng)的研究；石建平等對常規(guī)PCR法進(jìn)行了改進(jìn)，將試驗縮短到 4h 內(nèi)完成，提高PCR的效率，使PCR技術(shù)更趨于實用化；Katz等、劉麗娜等建立的套式PCR和多重PCR能有效區(qū)分野毒株和不同疫苗株。近年來，隨著這項技術(shù)的不斷進(jìn)步，檢測PRV與其他豬病病毒的PCR方法也相繼建立，這種多重PCR將成為分子生物學(xué)檢測和流行病學(xué)調(diào)查的常用方法。

（2）實時熒光定量PCR方法。實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time Fluo-rescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR)是20世紀(jì)90年代中期在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的高靈敏度的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、育種學(xué)、營養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域，應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊。2009年，趙麗等根據(jù)gH、gE基因先后建立了PRV實時定量熒光RCR、鑒別PR野毒與疫苗毒感染的熒光定量PCR兩種方法；呂建強等根據(jù)gD基因建立了PRV實時熒光RCR方法，最低檢測限可達(dá)1.42 pg/μl的總DNA；Ma W等根據(jù)gB、gE基因建立了快速檢測區(qū)分PR野毒與基因缺失疫苗毒的實時熒光定量PCR方法，能夠快速、特異地檢測出感染和潛伏感染野豬體內(nèi)的PRV。

五、展望

我國是世界第一養(yǎng)豬大國，生豬存出欄數(shù)及豬肉產(chǎn)量多年來位居世界第一，然而我國養(yǎng)豬業(yè)一直受到疫病問題的困擾，PR就是其中主要疫病之一。目前用于診斷PR的檢測方法很多，各有其優(yōu)缺點。傳統(tǒng)方法可靠，但往往操作較復(fù)雜或耗時較長，實際應(yīng)用中有一定的困難；血清學(xué)方法，特別是鑒別ELISA試劑盒的研制成功和廣泛應(yīng)用，不僅使PR的檢測變得簡便、快速、敏感，還可以鑒別野毒和疫苗毒；分子生物學(xué)方法靈敏度高、特異性好，隨著研究的深入和完善將會越來越被廣泛應(yīng)用。當(dāng)然，無論哪一種診斷檢測方法都不能徹底解決所有問題，可以根據(jù)檢測目的和要求進(jìn)行選擇和配合應(yīng)用，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早解決。同時，還應(yīng)不斷深入研究，建立更多快速、簡便、實用的檢測診斷方法，以更好的促進(jìn)該病的綜合防控和疫病凈化工作的開展。

（略）