溶菌酶的研究進展及應用

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(青島大學，山東 青島 266071)

溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁質酶(Muramidase), 廣泛存在于自然界，具有抗細菌、真菌及腫瘤等多種藥理作用，具有生物相容性好對組織無刺激性、無毒性的特點，已被制作為一種性質優(yōu)良殺傷病原微生物而不破壞機體的酶制劑。根據其分子結構和來源的不同分為6類：植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌體溶菌酶(主要為T4噬菌體)、C型(蛋清溶菌酶、胃溶菌酶等)、G型(鵝型溶菌酶)和I型(無脊椎動物溶菌酶)，其中C、G型和噬菌體溶菌酶最常見。溶菌酶化學性質穩(wěn)定，商品化主要為蛋清溶菌酶，僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用，為此國內外一直致力于開發(fā)改良新型溶菌酶。本文就溶菌酶的作用機制、目前的改良開發(fā)及應用情況進行綜述。

1 溶菌酶的作用機制

1.1抗細菌作用 溶菌酶是存在于動物體液及組織中的固有免疫因子，通過破壞細菌細胞壁激活細菌自溶蛋白，使膜通透性增大導致細菌裂解死亡，其機制如下：N-乙酰己糖胺酶水解細菌細胞壁肽聚糖的β-1,4糖苷鍵；酰胺酶水解細菌細胞壁內N-乙酰葡糖胺與肽橋之間的連接—N-乙酰葡糖胺-L-丙氨酸鍵及內肽酶水解細菌細胞壁肽橋內的肽鍵。蛋清溶菌酶是目前研究最為透徹的一種溶菌酶。通過X-射線衍射得到的晶體學數據，Phillips等最先提出蛋清溶菌酶催化糖苷鍵斷裂的能力來自靜電穩(wěn)定的碳正離子中間體及空間位阻效應，酶的活性位點與糖結合使其變構成半椅型構象，使糖苷鍵容易斷裂；之后Vocadlo等又發(fā)現酶結構中Glu35對于維持酶的活性至關重要，Glu35作為糖苷鍵的質子供體，切割底物碳氧單鍵，通過Asp52形成糖基酶中間體，隨后Glu35與水反應形成的氫氧根攻擊糖基酶中間體，水解生成產物，而酶保持不變。

蛋清溶菌酶不能直接殺傷革蘭氏陰性菌，源于革蘭氏陰性菌與陽性菌細胞壁中肽聚糖含量及膜結構的不同，但可通過與革蘭氏陰性菌中的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)結合，形成非競爭性抑制劑，進而減弱LPS與巨噬細胞及上皮細胞受體的相互作用，在一定程度上可以減輕組織的非特異性炎癥反應。

MCR-1是已知能進行基因水平轉移的第一個多粘菌素抗性基因[1]。最近發(fā)現MCR-1基因還能改變細胞外膜帶電水平，從而對溶菌酶產生交叉抗性[2]。另外，有些細菌能產生溶菌酶抑制劑以對抗溶菌酶。抑制劑錨定于細胞外表面或周質空間，通過封閉溶菌酶活性位點使細菌細胞壁不受外源溶菌酶的分解。

1.2抗真菌作用 類似于水解細菌細胞壁，溶菌酶能水解真菌細胞壁幾丁質的β-1,4糖苷鍵。此外溶菌菌酶中殼多糖酶可以分解真菌細胞壁殼多糖。β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露糖酶可分解酵母菌的細胞壁；Sowa等[3]發(fā)現溶菌酶溶壁后通過誘導真菌凋亡發(fā)揮作用，多項實驗也發(fā)現溶菌酶處理過的白色念珠菌表現出明顯的細胞凋亡特征：線粒體膜電位改變、磷脂酰絲氨酸暴露以及染色質固縮和DNA斷裂等。Smedowski等[4]在真菌性角膜炎研究中發(fā)現：角膜炎癥細胞的浸潤平均密度是細菌性感染的2～3倍 ，這表明了在真菌感染時控制炎癥反應，避免產生過強炎癥反應的重要性。溶菌酶可抑制高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)的釋放和內皮細胞中白細胞的遷移，抑制TNF-α、IL-1β及MCP-1等炎癥因子在人內皮細胞中的表達。Lee等[5]也證明溶菌酶減輕炎癥后期反應的機制之一是抑制HMGB1信號通路，降低其表達改善預后。

在我國真菌病屬于高發(fā)常見病，而抗真菌藥療效差、毒副作用大。因此亟待尋找低毒高效的新型抗真菌藥物。溶菌酶性質優(yōu)良具有較強的抗真菌活性，如綠豆溶菌酶等植物溶菌酶、海洋分支桿菌溶菌酶等對煙曲霉菌、茄病鐮刀菌、腐皮霉菌、白色假絲酵母等均具有殺菌療效，可以作為潛在的新型抗真菌藥物[6-7]。

1.3抗病毒作用 溶菌酶抗病毒的報道相對較少。機制之一作為堿性蛋白質，在體內中性條件下可攜帶大量正電荷，作為陽離子蛋白與帶負電荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使侵入機體的病毒失活[8]。另外，通過激活機體免疫系統(tǒng)，調節(jié)淋巴細胞和巨噬細胞介導的細胞毒作用殺傷病毒。因此，溶菌酶可以作為一種安全的輔助抗病毒藥物使用。

1.4抗腫瘤作用 從Shumacher等發(fā)現溶菌酶可以抑制腫瘤的生長和轉移，溶菌酶對腫瘤的治療研究已有50年的歷史。資料顯示有些溶菌酶對大多數腫瘤細胞起作用，甚至是惡性淋巴瘤，減少腫瘤細胞密度并延長動物的存活時間[9]。常用的蛋清溶菌酶抗腫瘤效果不明顯，而鯊魚軟骨溶菌酶則具有較強的抗腫瘤活性，通過直接或間接激活機體免疫系統(tǒng)，調節(jié)淋巴細胞和巨噬細胞介導的細胞毒作用。海洋微生物溶菌酶還具有類似于血管生成抑制因子的作用，體外實驗顯示可抑制血管內皮細胞的增殖與遷移，通過抑制新生血管的生成來抑制腫瘤組織的生長。此外，溶菌酶聯(lián)合絲裂霉素等化療藥物還可優(yōu)化化療效果，因此可作為輔助藥物，增強治療效果，改善愈后。

研究還發(fā)現HMGB1在癌變組織中表達量增高，胞外的HMGB1可以促進腫瘤細胞的遷移，這對腫瘤細胞侵潤尤為重要。將肺癌細胞注射至小鼠皮下，給予HMGB1抗體即可抑制后期腫瘤細胞的轉移，HMGB1不僅在炎癥后期起重要促炎作用，還可引起晚期糖基化終產物(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)增多，RAGE與細胞粘附聚集有關，是腫瘤治療的靶點之一[10]。而溶菌酶可以降低HMGB1表達量，可能通過抑制HMGB1-RAGE通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

2 溶菌酶的改良開發(fā)

溶菌酶化學性質相對穩(wěn)定，一般等電點在10～11左右，最適pH為在6～7之間，不同溶菌酶最適溫度差別可較大。新的溶菌酶開發(fā)主要是從各種生物中發(fā)現具有較強活性、性質獨特的酶系，或對現有溶菌酶進行化學修飾、吸附等以增強其生物活性，或賦予其新的性質。 介質吸附提高酶活：例如溶菌酶吸附于納米銀粒子，抗大腸桿菌活性提高了35%[11]。然而與無機納米顆粒相比，天然大分子制備而成的有機納米顆粒生物相容性更好。因此，Frank等 通過將溶菌酶與聚乙二醇或聚丙二醇復合生產出一種具有抗菌活性、可注射用的低免疫原性的溶菌酶復合物。Hashemi等[12]發(fā)現溶菌酶和阿拉伯樹膠交聯(lián)使用可以增強溶菌酶的廣譜抗菌活性，并且產物具有低溫不結晶析出、不易被微生物侵蝕、無刺激性無毒等多種優(yōu)良性質，可以應用于食品保鮮防腐等領域。還有許多交聯(lián)物與溶菌酶交聯(lián)可增強溶菌酶活性，如黃芪膠等植物膠、EDTA-2Na等螯合劑、烷基化合物、植物精油、紫蘇醛等[13-15]。

化學修飾廣泛應用于改良酶的性質，賦予酶更強的活性、更穩(wěn)定的性質。常見的修飾類型有乙?；Ⅴ０坊?、酯化、琥珀?；?、磷酸化、硫醇化和糖基化等，例如：糖基化可以改變蛋白表面電荷，從而改變蛋白的親疏水性，影響蛋白質-水互作和蛋白-蛋白互作，從而引起構象改變，影響蛋白質功能。Ladan等[16]利用美拉德反應糖基化蛋清溶菌酶，然后用棕櫚酸進行脂化，發(fā)現產物具有極強的抗大腸桿菌活性。Takahashi等則將糖和脂肪?；Y合并與溶菌酶交聯(lián)形成綴合物，盡管產物的殺菌活性降低了，但更加穩(wěn)定并具有較強的蛋白酶抗性，變性溫度增加到了74 ℃。

有一部分溶菌酶由于其所處的特殊環(huán)境，導致性質不同于一般溶菌酶，如反芻動物牛瘤胃中的胃溶菌酶，能夠在富含胃酸和胃蛋白酶的環(huán)境中發(fā)揮作用，因而在低pH等情況下具有很好的應用潛力。海洋特殊的高鹽、高壓、低溫(或高溫)、低營養(yǎng)等環(huán)境，使海洋生物所產的溶菌酶也具有一些獨特性質，如嗜低溫(嗜高溫)、抗氧化作用強、廣譜殺菌等。分析氨基酸殘基發(fā)現，嗜低溫酶相比中溫酶含有大量帶負電荷的氨基酸殘基，主要是是天冬氨酸殘基，因此缺乏離子鍵，分子呈相對“松散”狀態(tài)而具有較大可變性，使其能在低溫環(huán)境下仍能維持較高的催化活性。嗜高溫酶中亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及精氨酸含量較高。一定程度說明了蛋白質氨基酸組成與熱穩(wěn)定的關系，這對蛋白質工程改造替換氨基酸具有重要意義。

對一些獨特性質的酶，可以利用交聯(lián)有機大分子、化學修飾、蛋白酶切等手段增強酶的優(yōu)良性質。開發(fā)藥物關鍵在于發(fā)現具有生物活性的新型化合物或先導物，從動植物及微生物中發(fā)現提取新型生物活性物質，是新藥研究的重要選擇。利用宏基因組、功能基因篩查及測序分析找到新型溶菌酶。通過發(fā)酵與基因工程相結合，或利用動植物生物反應器如乳腺生物反應器等，較容易實現大規(guī)模生產，進而獲得高效、安全的新型藥物。

3 溶菌酶的應用

3.1溶菌酶在醫(yī)學領域的應用 溶菌酶在人體內非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用，具有殺菌抗炎，促進組織修復及增強免疫力等多種生物活性作用，是一種性質優(yōu)良的藥用酶，因而已廣泛應用于醫(yī)藥領域，例如治療急慢性鼻咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹及扁平疣等，偶有較輕的過敏反應。

對于常見的腸道微生態(tài)菌群失調引起的腹瀉、腸源性內毒素血癥等，及陰道微生態(tài)平衡失調、厭氧菌和加德納菌過剩生長所引起的炎性綜合征等，抗生素殺菌療效雖好但同樣會殺傷益生菌，耐藥菌成為新的優(yōu)勢菌造成情況惡化。而溶菌酶通過殺死腸道腐敗球菌，促進益生菌雙歧乳酸桿菌的增殖，扶植正常菌群提升免疫力，保護微生態(tài)環(huán)境增加腸道抗感染力。

在目前的研究中，已將海洋微生物發(fā)酵得到的溶菌酶膜劑成功用于治療細菌性陰道炎，臨床療效顯著[17]。從牡蠣中提取的海洋溶菌酶，已被用于制造海婦潔膜，治療細菌性陰道炎，無毒無刺激性，放置后對胎兒和新生兒均無影響，療效肯定，使用方便且不易產生耐藥性[17]。

3.2溶菌酶在食品工程的應用 微生物引起的腐敗會導致食品質量及食用價值下降，甚至可能導致食物中毒。因此，殺滅微生物對食品質量及安全十分重要。目前常用的手段有干燥、加熱、排除空氣、紫外線照射、添加防腐劑等，但對各項措施副作用的擔憂也越來越多。因此，溶菌酶等天然抗菌活性物質逐漸登上食品工程的舞臺，一些溶菌酶具有無毒防腐、抗氧化及溶菌譜廣等特點功效，與一些化學試劑配伍后還可增強活性[18]。歐盟在2000年已經允許在海產品、奶酪等乳制品、豆類產品、葡萄酒等酒類及紅腸等肉類中添加溶菌酶，作為一種安全廣譜的殺菌防腐劑。

Cooper等[19]發(fā)現可以使用溶菌酶治療大腸桿菌引起的仔豬腹瀉，因此可以用作飼料的防腐劑和保健添加劑。又如人乳中含有大量溶菌酶，遠高于牛乳，可在動物乳制品中添加溶菌酶，使牛乳“人乳化”，有利于維持嬰兒腸道微生物群正常同時還能促進嬰兒腸道雙歧乳酸桿菌增殖，促進乳酪蛋白凝乳利于消化。所以溶菌酶又是嬰幼兒食品的良好添加劑 。海產品一般在低溫下儲藏，低溫會限制大多數酶的使用效果。海洋生物特別是生活在極端環(huán)境下的海洋微生物能產生豐富的極端酶，具有更為獨特的酶學性質，如嗜低溫幾乎不受金屬離子等添加劑的影響等，已引起國內外研究人員的極大關注。

此外，溶菌酶還可用于分解細胞壁，制備原生質體，及用于微生物分類和育種，作為遞送藥物蛋白及研究蛋白質功能結構的模式蛋白等，已成為細胞工程和基因工程中不可或缺的工具酶之一[20]。近年來，隨著生物技術的發(fā)展，尋找具有全新性質的酶已成為酶制劑研究的熱點。據統(tǒng)計，人們已經從微生物中發(fā)現了10 000多種具有生物活性的代謝產物，許多具有開發(fā)前景的生物活性物質并不是由動植物產生的，而是由與其共生的微生物產生的。海洋微生物資源豐富、種類繁多，幾乎包括所有微生物類型，能產生豐富的極端酶，其生物多樣性遠遠多于陸地生物多樣性。利用宏基因組手段，篩查環(huán)境中的微生物，發(fā)現具有優(yōu)良性質的新型酶，利用發(fā)酵、生物反應器等手段或結合基因工程實現規(guī)模生產，獲得高純高效的酶類，例如通過生物發(fā)酵得到的海洋溶菌酶以其顯著療效已引起了極大關注。因此，溶菌酶在醫(yī)藥、生產科研等領域具有獨特的優(yōu)勢和廣闕的應用前景。