草魚呼腸孤病毒VP56蛋白抗血清中和效果的檢測

（河南師范大學水產學院，河南新鄉(xiāng)453007）

草魚（Ctenopharyngodon idellus） 屬鯉形目鯉科魚，是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。草魚是中國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，因食性簡單、餌料來源廣泛且生長迅速、產量高，常被作為池塘養(yǎng)殖和湖泊、水庫、河道的主要放養(yǎng)對象。草魚以其肉質鮮美、富含高蛋白、高不飽和脂肪酸和較低的脂肪而備受消費者喜愛。但草魚在養(yǎng)殖過程中的“四病”如赤皮病、爛鰓病、腸炎病、出血病，制約著草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。其中以草魚出血病危害最為嚴重，其流行范圍廣、發(fā)病快、死亡率高，一旦爆發(fā)，死亡率可達90%以上，給我國草魚養(yǎng)殖產業(yè)造成巨大的經濟損失[1]。1972年首次報道此病，1978年初步確定其病原為病毒[2]，1983年，陳燕焱等從草魚出血病中分離出一株病毒，鑒定其為水生呼腸孤病毒屬（Aquareovridae）[3]，1984年通過對病毒精細結構與核酸特性的研究，確認病原為呼腸孤病毒[4-5]，1995年，國際病毒分類命名委員會正式將草魚出血病病毒命名為草魚呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）。

草魚呼腸孤病毒顆粒呈5∶3∶2對稱正二十面體，雙層衣殼，無囊膜，病毒基因組為雙鏈RNA，包含11個片段(S1-S11)，編碼七個結構蛋白質(VP1-VP7)和五種非結構蛋白質[6-7]。GCRV自首次被分離鑒定至今，已有40多株病毒株被報道。根據(jù)VP6基因序列比對將已分離的GCRV病毒株劃分為3種基因型，GCRV-I型(代表株為GCRV-873)、GCRV-II 型(代表株為 GCRV-HZ08)、GCRV-III型(代表株為GCRV-104)。根據(jù)我國流行病檢測結果，II型草魚呼腸孤病毒是目前引起草魚出血病的主要病原株[8]。

Ⅱ型草魚呼腸孤病毒VP56蛋白由基因組S7片段編碼的512個氨基酸組成[9]，分析發(fā)現(xiàn)該VP56蛋白結構非常特殊，具有和腺病毒的纖維突起蛋白相似的結構，因此稱之為類纖突蛋白。已知腺病毒是依靠其衣殼上的纖突蛋白首先與細胞接觸，然后入侵細胞，在病毒入侵的過程中起著至關重要的作用。并且纖突蛋白具有良好的免疫原性，利用纖突蛋白制備的抗體能夠中和腺病毒，使其失去感染能力。有學者預測VP56可能作為病毒的黏附蛋白與寄主細胞膜上的特異性受體結合[10-11]。本實驗從患有草魚出血病的草魚組織中分離草魚呼腸孤病毒，并稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5病毒液，注射草魚，統(tǒng)計草魚的死亡情況，按照Reed-Muench法測定該病毒的LD50。然后利用已獲得的鼠抗VP56抗血清進行中和試驗，來檢測制備的抗體對病毒的中和效果。將鼠抗 VP56 抗血清按 1∶4、1∶16、1∶64稀釋后和200 LD50的草魚呼腸孤病毒混合，腹腔注射草魚，作為實驗組；對照組注射正常小鼠血清和病毒混合液，空白組只注射PBS，然后統(tǒng)計草魚死亡情況。實驗結果表明抗VP56蛋白抗血清對草魚呼腸孤病毒具有一定中和能力，能夠抑制病毒活性，延緩受感染魚的發(fā)病，降低死亡率。本研究可能為預防和治療草魚出血病提供一種潛在的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚、草魚呼腸孤病毒、鼠抗VP56蛋白抗血清、正常小鼠血清。

主要試劑與儀器：PBS、0.22 μm濾器、注射器、研缽、離心機、恒溫加熱器。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗魚的處理

實驗前一周，選取體長在4.45±0.22 cm，體重0.83±0.05 g，健壯無病的同一批次草魚魚種，在28℃水溫中充氧飼養(yǎng)，讓其適應一周。

1.2.2 病毒LD50的測定

取0.2 g病魚內臟，加入10倍體積PBS充分研磨成勻漿，3000 r/min離心20 min，取上清液，配制成10-1懸液。將懸液以10倍遞次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5。每組設置5條草魚，總共分五組，每個稀釋度為一組。對所有實驗魚進行腹腔注射，每尾注射0.1 mL稀釋后的病毒懸液。之后，用恒溫加熱器讓水溫維持在28℃，每日觀察各組的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察14 d。然后按照Reed-Muench法計算出該病毒的LD50。

1.2.3 中和試驗

將抗VP56抗血清和正常小鼠血清在56℃下滅活30 min，并用PBS稀釋，稀釋梯度分別為1∶4、1∶16和1∶64。然后將稀釋的血清與200 LD50的病毒以1∶1的比例混合，在25℃下孵育1 h。每組設置10條草魚，每條草魚注射如上所述制備的0.1 mL混合物（含有200 LD50的病毒與血清混合液）。實驗組草魚注射稀釋的抗VP56抗血清與病毒的混合液，對照組草魚注射稀釋的正常小鼠血清與病毒的混合液，只注射PBS而沒有病毒和血清的一組魚作為空白對照。之后，用恒溫加熱器讓水溫維持在28℃，每日觀察草魚的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察18 d。

2 實驗結果

表1 Reed-Muench法測定病毒LD50數(shù)據(jù)表Table 1 VirusLD50determinedbyReed-Muenchmethod

2.1 病毒LD50的測定結果

由表1可知，死亡率高于50%的最大稀釋倍數(shù)為10-3，死亡率為67%；死亡率低于50%的最小稀釋倍數(shù)為10-4，死亡率為14%。按照Red-Muench法計算，該病毒懸液作103.3稀釋后，注射0.1 mL可引起草魚半數(shù)死亡。

2.2 中和試驗測定結果

表2 中和試驗期間魚體存活數(shù)量表Table 2 Fish survival numbers during the test

經過10 d的詳細觀察和記錄，統(tǒng)計了中和試驗期間魚體存活的數(shù)量。在實驗前3 d，所有草魚均表現(xiàn)正常。第4 d，正常血清與病毒混合組（1∶4）草魚出現(xiàn)緩慢游動和出血性疾病的癥狀，并且有一定數(shù)量的魚死亡。隨后，在第5 d時，抗VP56抗血清與病毒混合組和PBS組均未有死亡，而正常血清組（1∶16和1∶64） 開始有魚死亡。抗VP56抗血清組（1∶64） 草魚第6天開始死亡。而抗VP56抗血清組(1∶4和1∶16)的死亡延遲至第7 d。在整個實驗期間 （10 d），抗 VP56 抗血清組 （1∶4 和 1∶16）和正常血清組（1∶16），草魚均有10%存活下來，而抗VP56抗血清組（1∶64） 和正常血清組（1∶4和1∶64） 全部死亡。

3 討論

草魚出血病作為一種嚴重危害草魚健康的傳染性疾病，發(fā)病季節(jié)長，流行范圍廣，死亡率高，可引起草魚魚種大量死亡，給我國草魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重危害。草魚出血病的病原為草魚呼腸孤病毒，該病毒已被證實是致病力最強的水生呼腸孤病毒。國內目前對于草魚出血病的預防及治療做了大量研究，發(fā)現(xiàn)化學藥物很難達到治療目的，并且還可能導致魚體和水體有藥物殘留，而免疫技術在該疾病的防治上卻取得了一定成就。近年來，針對草魚呼腸孤病毒的研究，以及對草魚呼腸孤病毒疫苗的研制逐步深入，并且取得了一定的進步[12-14]。我們在本實驗中檢測了草魚呼腸孤病毒的LD50，并進一步探究了抗VP56蛋白抗血清與草魚呼腸孤病毒的中和能力。在整個實驗期間（10 d），抗VP56抗血清與病毒混合液組（1∶4和1∶16） 和正常血清與病毒混合液組（1∶16），草魚均有10%存活下來，而抗VP56 抗血清組 （1∶64） 和正常血清組 （1∶4 和 1∶64）全部死亡，并且注射抗血清與病毒混合液組草魚的發(fā)病和死亡時間延后。實驗結果表明抗VP56抗血清可以一定程度上抑制草魚呼腸孤病毒的活性，延緩受感染魚的發(fā)病，降低死亡率。本研究可能為采用被動免疫療法預防和治療草魚出血病提供一種潛在的策略。