正交試驗(yàn)法優(yōu)選痛利舒顆粒水提工藝

楊龍飛，丁曉彥，高燕，國錦，孫啟慧，趙渤年

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東省中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

痛利舒顆粒是由茵陳、葛根、白芍、梔子等15味中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱利濕、化瘀止痛、益氣滋陰之功效，臨床上對(duì)痛風(fēng)具有顯著的療效。由于傳統(tǒng)湯劑有煎煮不方便、服用量大、質(zhì)量不可控、不易儲(chǔ)存和攜帶等弊端，為了提高臨床療效、保證藥品質(zhì)量，使該處方更好地服務(wù)于臨床和廣大病患，對(duì)湯劑進(jìn)行了劑型改革。通過對(duì)處方的分析，在查閱文獻(xiàn)[1-10]和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)各藥物的理化性質(zhì)和藥理作用，確定了本制劑的提取工藝。該制劑水提取工藝的優(yōu)化研究，為痛利舒顆粒的工業(yè)生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；Thermo Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BP211D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.2 試劑

乙醇、甲醇、磷酸為分析純；乙腈為色譜純；高效液相色譜用水為超純水。

1.3 試藥

生地、山藥、枸杞、白術(shù)、蒼術(shù)、白芍、梔子、茵陳、葛根、丹參、黃芪、牛膝、地骨皮、澤瀉、甘草(山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司中藥飲片廠，質(zhì)量合格)；梔子苷(批號(hào)：0095-201101RS，云南特法特生物科技有限公司)；芍藥苷(批號(hào)：110736-200731，中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法與結(jié)果

2.1 得膏率的測(cè)定

按處方量稱取飲片，按正交設(shè)計(jì)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，合并濾液，將藥液轉(zhuǎn)移至干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃條件下干燥3 h，轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻30 min，稱重并計(jì)算各次實(shí)驗(yàn)的得膏率:

2.2 梔子苷含量測(cè)定

2.2.1 樣品溶液的制備

2.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取梔子苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成50 μg/mL的溶液，即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備

取正交試驗(yàn)工藝提取所得干膏1.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理20 min(53 Hz，300 kW)，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[11]。

2.2.1.3 陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取除梔子以外的其他藥味，按照樣品制備方法制備陰性樣品，取陰性樣品約1.2 g，按2.2.1.2項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.2 色譜條件

2.2.3 專屬性考察

吸取不同樣品溶液各10 μL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，供試品溶液色譜與對(duì)照品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，分離度良好，陰性無干擾。色譜圖見圖1～3。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取不同體積對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，測(cè)定，得回歸方程：y=2×106x+9 782.4，r=0.999 5，結(jié)果表明，梔子苷在0.10～1.02 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取梔子苷對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.11%，表明儀器精密度良好。

圖1 梔子苷對(duì)照品溶液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the reference solution of Gardenoside

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Tonglishu Granule

圖3 缺梔子陰性樣品溶液HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Gardenia Fructus negative control

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取5號(hào)干膏粉末1.5 g，平行6份，精密稱定，按2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液(5號(hào))分別在第0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果梔子苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取5號(hào)干膏粉末0.75 g，平行5份，精密稱定，分別精密加入濃度為1.89 mg/mL的梔子苷對(duì)照品溶液1 mL，按照2.2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算得平均回收率為100.58%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.05%。

2.3 芍藥苷的含量測(cè)定

2.3.1 樣品溶液的制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取芍藥苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成30 μg/mL的溶液，即得。

2.3.1.2 供試品溶液的制備

取正交試驗(yàn)工藝提取的干膏1.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min(53 Hz，300 kW)，放冷，稱重，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[11]。

2.3.1.3 陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取除白芍以外的其他藥味，按照樣品制備方法制備陰性樣品，取陰性樣品約1.4 g，按2.3.1.2項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.2 色譜條件

2.3.3 專屬性考察

吸取不同樣品溶液各10 μL，測(cè)定，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液色譜與供試品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，分離度良好，陰性無干擾。色譜圖見圖4～6。

圖4 芍藥苷對(duì)照品溶液HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of the reference solution of Paeoniflorin

圖5 供試品溶液HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of Tonglishu Granule

圖6 缺白芍陰性樣品溶液HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of Radix paeoniae alba negative control

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取不同體積對(duì)照品溶液注入色譜儀，測(cè)定，得回歸方程：y= 1×106x+24 867， r=0.999 9，結(jié)果表明，芍藥苷在0.06～0.60 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

吸取芍藥苷對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取5號(hào)干膏1.5 g，平行6份，精密稱定，按2.3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.79%，該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液(5號(hào))分別在第0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算各樣品中芍藥苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.34%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取5號(hào)干膏粉末0.75 g，平行5份，精密稱定，分別精密加入濃度為33.5 μg/mL芍藥苷對(duì)照品溶液1 mL，按照2.3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算得平均回收率為99.49%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.50%。

2.4 水提工藝的優(yōu)選

研究資料表明[12-13]，梔子、白芍等藥味中的有效成分均具有較好的水溶性，且臨床應(yīng)用時(shí)多以水煎劑為主，故在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水為提取溶劑，采用L9(34)正交試驗(yàn)法，選取加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)和煎煮次數(shù)(C)制定因素水平表，以得膏率、梔子苷及芍藥苷含量作為考察指標(biāo)，優(yōu)選水提工藝。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 水提工藝正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The orthogonal factor level table of water extraction process

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

評(píng)價(jià)水煎煮工藝效果的主要指標(biāo)為梔子苷與芍藥苷含量，故將含量測(cè)定權(quán)重系數(shù)定為0.6，芍藥苷和梔子苷含量各自為0.3，得膏率在實(shí)際生產(chǎn)中也有重要意義，權(quán)重系數(shù)定為0.4。

綜合評(píng)分

×0.4。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 水煎煮工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of water extracting technology

表3 方差分析結(jié)果表Table 3 Results of the variance analysis

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提工藝的煎煮次數(shù)(C)對(duì)梔子苷與芍藥苷的含量和得膏率有顯著性影響，以C3為最佳，而對(duì)加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)的影響較小，二者可任選一水平，根據(jù)綜合評(píng)分結(jié)果，并考慮到節(jié)約能源，降低成本，故選用A2、B2。因此，最佳組合為A2B2C3，即在水提工藝中選用8倍量水，煎煮3次，每次煎煮2 h為水提工藝的適宜條件。

2.6 討論

痛風(fēng)在臨床上主要表現(xiàn)為高尿酸血癥，是由嘌呤類物質(zhì)代謝紊亂引起的血尿酸濃度持續(xù)增高，而使尿酸鹽結(jié)晶沉積在軟組織所導(dǎo)致的一組代謝性疾病[14]。

痛利舒顆粒為多味藥組成的復(fù)方，在臨床上治療痛風(fēng)作用顯著，且克服了湯劑使用不便、服用量大、不易儲(chǔ)存攜帶等缺陷。為達(dá)到提取工藝可控、穩(wěn)定的目的，本研究采用多指標(biāo)綜合評(píng)分來優(yōu)化提取工藝。根據(jù)各藥味中成分特點(diǎn)，以水為提取溶劑，成本低、安全性高，且與傳統(tǒng)中醫(yī)用藥方法相契合。

指標(biāo)的選擇與綜合評(píng)分權(quán)重比例是根據(jù)其藥理作用、在制劑中的含量及其在生產(chǎn)中的意義決定的，方中梔子與白芍均可降低血清中尿酸水平[15-16]，故將其作為評(píng)價(jià)提取工藝的主要指標(biāo)，并采用HPLC測(cè)定梔子苷與芍藥苷的含量。通過方差分析，最終確定8倍量水，煎煮3次，每次煎煮2 h為水提工藝適宜條件。優(yōu)選出的提取工藝具有科學(xué)性和合理性，可作為痛利舒顆粒生產(chǎn)中提取工藝的參考，并為下一步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究制定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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