三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯誘發(fā)肝臟損害及病理改變研究

李學(xué)彥，王思敏，周啟星,*，邵曉東，張永國，胡獻(xiàn)剛

1. 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科，沈陽110016 2. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350

有機(jī)磷阻燃劑(OPFRs)已在商業(yè)上得到廣泛使用，主要應(yīng)用于增塑劑配方、液壓油、潤滑劑、粘合劑和聚氨酯泡沫塑料、橡膠和紡織涂層等。有機(jī)磷阻燃劑主要分為不含鹵素的有機(jī)磷阻燃劑和含鹵素的有機(jī)磷阻燃劑，含鹵素的有機(jī)磷阻燃劑主要包括三(氯丙基)磷酸酯、三(2-氯乙基)磷酸酯和三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(TDCPP)等[1]。由于有機(jī)磷阻燃劑是通過非化學(xué)鍵添加到產(chǎn)品中，因此很容易釋放到環(huán)境中，已經(jīng)在室內(nèi)空氣[2]、房屋灰塵[3]、飲用水、沉積物和生物組織中檢測到了有機(jī)磷阻燃劑[4]。TDCPP與有機(jī)磷農(nóng)藥有相似的結(jié)構(gòu)，已有研究證明TDCPP能夠?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響[5-6]；近期研究也表明，TDCPP會(huì)干擾動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)[7-8]；一些研究還認(rèn)為，暴露于TDCPP的禽類胚胎中含有異生代謝產(chǎn)物和免疫應(yīng)答的肝相關(guān)基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變[9]；斑馬魚暴露于TDCPP的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TDCPP能夠顯著改變肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[10]。但是，目前對TDCPP影響哺乳類動(dòng)物肝臟毒性方面的研究還相對缺乏，并且由于環(huán)境中存在的有機(jī)磷阻燃劑不斷被檢出，其帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和健康危害越來越受到人們的關(guān)注。

本研究主要觀察典型有機(jī)磷阻燃劑TDCPP對大鼠肝臟的毒性效應(yīng)及其程度，并探討其發(fā)生機(jī)理，為有機(jī)磷阻燃劑的污染防治和相關(guān)疾病的有效治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

SPF級SD大鼠購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；TDCPP(>95%, Tokyo Chemical Industry, 日本)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；特級初榨橄欖油購自西班牙阿布利爾。

瑞士Tecan多功能酶標(biāo)儀平臺(tái)Spark 10M；美國MD2880全自動(dòng)生化分析儀；日本日立H-7650透射電鏡；離心機(jī)(德國Eppendorf-5430)；切片機(jī)(德國萊卡RM2015)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物配制

TDCPP溶于橄欖油中配制藥物，依據(jù)TDCPP對大鼠的半致死劑量，染毒組的暴露劑量分別為TDCPP半致死劑量的1/16、1/8和1/4，即125 mg·kg-1·d-1, 250 mg·kg-1·d-1和500 mg·kg-1·d-1，通過灌胃的方式給藥，每日給藥一次。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

6～8周SPF級雄性SD大鼠60只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，每天12 h/12 h燈光白晝交替照射，室內(nèi)溫度控制22～24 ℃，濕度40%～60%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水及進(jìn)食。

60只雄性大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只：空白組(Control)，不做任何處理；溶劑對照組(Solvent)，每天以相同體積的橄欖油灌胃；低劑量組，灌胃劑量為125 mg·kg-1·d-1；中劑量組，灌胃劑量為250 mg·kg-1·d-1；高劑量組，灌胃劑量為500 mg·kg-1·d-1。每周準(zhǔn)確稱取大鼠體重。并于第4、8周采用眼眶內(nèi)眥方法取血。第8周末在各組中隨機(jī)抽取3只大鼠，禁食12 h，以0.3 mL·(100 g)-1劑量注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血法收集血液，分離血清，取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，一部分固定在甲醛中，一部分凍存在-80 ℃冰箱待檢。

1.2.3 肝功能檢測

在大鼠染毒期間的第4周和第8周，從不同組中分別隨機(jī)選取6只大鼠，采用眼眶內(nèi)眥法取血1～2 mL，靜置30 min，4 ℃、2 500 r·min-1離心15 min，取血清置于離心管中。用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、膽固醇(CHO)和甘油三酯(TG)。

1.2.4 乙酰膽堿酯酶和氧化指標(biāo)檢測

乙酰膽堿酯酶(AChE)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)使用南京建成試劑盒測定。

1.2.5 肝臟HE染色病理切片

切取適量肝臟組織后，迅速放入10%的福爾馬林中固定48 h。用石蠟包埋肝組織，切片機(jī)切片，切片厚度控制在4～6m，用蘇木精-伊紅染色。

1.2.6 透射電鏡觀察肝臟超微結(jié)構(gòu)變化

切取適量肝臟組織后，用2.5%的戊二醛溶液4 ℃固定過夜。用0.1 mol·L-1、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品；用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h；再次漂洗；脫水處理；包埋劑包埋；切片機(jī)切片，獲得70～90 nm的切片；切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min；在透射電鏡中觀察肝臟超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0和ORIGIN進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 TDCPP對大鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在8周的給藥期間，TDCPP灌胃能夠引起大鼠體重降低，且隨著灌胃劑量的增加，大鼠體重下降越明顯，在8周的給藥期間TDCPP染毒組的大鼠均表現(xiàn)為體重驟減，皮毛缺少光澤等不良狀態(tài)，其中高劑量染毒組大鼠死亡一只。每周體重變化見圖1，體重在灌胃一周后開始發(fā)生差異，與空白對照組和溶劑對照組相比較，TDCPP處理組大鼠的體重有下降的趨勢，且具有顯著性(*P<0.05)，其中高劑量灌胃組的體重下降最為明顯(**P<0.01)。

2.2 血清肝功指標(biāo)

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)在肝臟代謝中發(fā)揮重要作用，催化丙氨酸和天冬氨酸中的α-氨基轉(zhuǎn)化為酮戊二酸中的α-酮基，分別生成丙酮酸和丁酮二酸[11]。ALT和AST活性水平常常作為肝毒性作用的實(shí)驗(yàn)室生物標(biāo)志物，反映肝臟損傷。因此，為了評估TDCPP誘導(dǎo)的肝毒性，本實(shí)驗(yàn)在第4、8周末，每組隨機(jī)選取6只大鼠檢測血清中ALT和AST水平(圖2a、2b)，同時(shí)檢測血清中膽固醇和甘油三酯水平以反映血清中脂質(zhì)含量(圖2c、2d)。

圖1 三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(TDCPP)暴露8周后不同處理組的體重注：*TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組比較P<0.05， **TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組比較P<0.01。Fig. 1 The body weight of rats at different groups after tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCPP) exposure for 8 weeksNote: Compared with blank control and solvent control,*P<0.05, **P<0.01.

結(jié)果顯示，與空白對照組和溶劑對照組相比較，TDCPP染毒組大鼠血清ALT含量在第4周時(shí)出現(xiàn)下降趨勢，且具有顯著性(*P<0.05)，第8周時(shí)出現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(*P<0.05)；TDCPP染毒組大鼠血清AST含量在第4周時(shí)與對照組相比較無顯著差異，在第8周時(shí)，AST顯著性降低(*P<0.05)，其中中劑量灌胃組下降最為明顯(**P<0.01)；染毒組血清膽固醇含量在第4周時(shí)并無明顯變化，第8周染毒組的膽固醇含量降低，且具有顯著性(*P<0.05)；染毒組血清甘油三酯的含量在第4周時(shí)與對照組相比較沒有顯著變化，在第8周時(shí)顯著性降低(*P<0.05)，其中，高劑量染毒組的甘油三酯含量降低最為明顯(**P<0.01)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，第4周和第8周大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽固醇和甘油三酯的檢測結(jié)果在各給藥組之間無顯著性差別(P>0.05)。

2.3 血清乙酰膽堿酯酶(AChE)活性與丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性

乙酰膽堿酯酶(AChE)與細(xì)胞的發(fā)育和成熟有關(guān)，參與細(xì)胞的遷移并影響炎癥及免疫反應(yīng)[12]。作為一種靈敏的生物標(biāo)志物，AChE能夠?qū)Νh(huán)境中污染物的毒性做出快速應(yīng)答，因此該方法被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥等毒物的監(jiān)測中。本實(shí)驗(yàn)在第8周末，每組隨機(jī)選取6只大鼠檢測血清中AChE水平(圖3a)；同時(shí)，為了檢測TDCPP所引起的氧化損傷，本實(shí)驗(yàn)還檢測了第8周大鼠血清中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性(圖3b和3c)。

圖2 TDCPP暴露4周和8周后對大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽固醇和總甘油三酯的影響注：*TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組比較P<0.05，**TDCPP處理組與空白對照組和溶劑對照組比較P<0.01。Fig. 2 The changes of the activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), and the contents of cholesterol (CHO) and triglyceride (TG) in serum of the rats after TDCPP exposure for 4 and 8 weeksNote: Compared with blank control and solvent control,*P<0.05, **P<0.01.

結(jié)果顯示，TDCPP染毒組與空白對照組和溶劑對照組相比較，染毒組AChE的活力顯著性下降(*P<0.05，**P<0.01)，且具有劑量依賴性。圖3a顯示高劑量給藥組與中劑量給藥組相比較、高劑量給藥組與低劑量給藥組相比較AChE活性均顯著性下降(#P<0.05)，表明隨著染毒劑量的升高，肝細(xì)胞受到損害越嚴(yán)重，導(dǎo)致AChE活性顯著性下降。圖3b和3c顯示，與對照組相比較，染毒組的MDA水平顯著性升高，SOD活性顯著性降低(*P<0.05，**P<0.01)，其中，MDA含量組間比較結(jié)果顯示，TDCPP所引起血清中MDA含量的升高具有劑量依賴性，即隨著TDCPP染毒劑量的升高，血清中MDA含量升高現(xiàn)象越顯著，高劑量給藥組與低劑量給藥組相比較MDA含量顯著性升高(#P<0.05)，表明TDCPP能夠?qū)Υ笫笤斐蓢?yán)重的氧化損傷。

2.4 肝臟組織HE染色石蠟切片和超微結(jié)構(gòu)觀察

光鏡下觀察不同組別大鼠肝細(xì)胞的一般形態(tài)，如圖4所示，空白對照組(圖4A)與溶劑對照組(圖4B)的肝組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，細(xì)胞分界清，核圓而清晰，位于細(xì)胞中央；低劑量染毒組中部分細(xì)胞核出現(xiàn)固縮壞死現(xiàn)象，可見少量的淋巴、中性粒細(xì)胞浸潤(圖4C)；中劑量染毒組(圖4D)發(fā)現(xiàn)肝小葉輪廓清晰，肝竇輕度擴(kuò)張和肝細(xì)胞彌漫性濁腫；高劑量染毒組(圖4E)肝臟組織嚴(yán)重?fù)p傷，肝正常組織結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞索排列不整齊，肝小葉輪廓不清，肝竇輕度縮窄；肝管上皮腫脹，可見壞死、脫落。透射電鏡觀察肝臟組織切片超微結(jié)構(gòu)(圖5A～E)，結(jié)果顯示，空白對照組(圖5A)和溶劑對照組(圖5B)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核和細(xì)胞器未出現(xiàn)損傷，低劑量染毒組肝細(xì)胞線粒體嵴融合(圖5C)；中劑量染毒組肝細(xì)胞核固縮變形，線粒體嵴出現(xiàn)融合現(xiàn)象(圖5D)；高劑量染毒組肝細(xì)胞核固縮變形，線粒體空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，并在肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了自噬結(jié)構(gòu)的形成(圖5E)。

圖4 不同處理組肝臟組織蘇木素、伊紅染色圖(×400)注：A，空白對照；B，溶劑對照；C，125 mg·kg-1·d-1；D，250 mg·kg-1·d-1；E，500 mg·kg-1·d-1。炎癥細(xì)胞在圖中用○標(biāo)注。Fig. 4 The illustration of the hematoxylin and eosin (HE) staining of liver tissues at different groups (HE×400)Note: A, Control; B, Solvent; C, 125 mg·kg-1·d-1 treatment; D, 250 mg·kg-1·d-1 treatment; and E, 500 mg·kg-1·d-1 treatment. Inflammatory cells were denoted by ○.

圖5 TDCPP暴露引起大鼠肝臟組織超微結(jié)構(gòu)損傷注：A，空白對照；B，溶劑對照；C，125 mg·kg-1·d-1；D，250 mg·kg-1·d-1；E，500 mg·kg-1·d-1。圖中損傷線粒體嵴融合用白色箭頭標(biāo)注，細(xì)胞核固縮變形用黑色箭頭標(biāo)注，線粒體空泡化用▲標(biāo)注，自噬結(jié)構(gòu)用□標(biāo)注。Fig. 5 The evidence of TDCPP-induced damage of hepatic ultrastructureNote: A, Control; B, Solvent; C, 125 mg·kg-1·d-1 treatment; D, 250 mg·kg-1·d-1 treatment; E, 500 mg·kg-1·d-1 treatment. The ridge fusion of damaged mitochondrial was denoted by white arrows; the contraction deformation of cell nucleus was denoted by black arrows; mitochondrial vacuolation was denoted by ▲; autophagosome was denoted by □.

由肝臟組織病理學(xué)檢測結(jié)果可知TDCPP可導(dǎo)致肝細(xì)胞呈現(xiàn)出不同程度的壞死，且隨著染毒劑量的增加，肝細(xì)胞的壞死程度越高。

3 討論(Discussion)

近年來，有機(jī)磷阻燃劑(OPFRs)作為阻燃劑和增塑劑廣泛應(yīng)用于商業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)中，世界范圍內(nèi)對OPFRs的需求量和生產(chǎn)量也在逐年增加。有機(jī)磷阻燃劑對于人類生活來說是必不可少的，但越來越多的OPFRs也隨之進(jìn)入到環(huán)境中，如大氣、土壤和水體。一方面，空氣顆粒物、室內(nèi)灰塵、辦公設(shè)備、食物和飲用水中均含有微量的有機(jī)磷阻燃劑，這些有機(jī)磷阻燃劑可以通過不同的方式參與到人類的生產(chǎn)和生活過程當(dāng)中，從而對人體健康產(chǎn)生潛在危害；另一方面，OPFRs也會(huì)進(jìn)入到生態(tài)系統(tǒng)中，進(jìn)而對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的不良影響[13]。

諸多研究表明，有機(jī)磷阻燃劑在不同濃度下對生物有著不同程度的影響，如引起魚類氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、抑制膽堿酯酶活性等[14-16]，引起嚙齒類動(dòng)物代謝紊亂[17]，影響禽類動(dòng)物甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)[18-19]。有研究表明，部分有機(jī)磷酸酯具有致癌性，因而使人們對其毒性的問題也日益關(guān)注。

肝臟作為機(jī)體內(nèi)最重要的解毒器官，可以將有毒物質(zhì)通過一系列代謝酶的作用，轉(zhuǎn)化為低毒或無毒產(chǎn)物，排出體外，轉(zhuǎn)氨酶在該過程中起著重要作用。本研究觀察到TDCPP可引起大鼠血清中的ALT和AST活性下降，在第4周時(shí)觀察到已有下降趨勢，在第8周時(shí)，染毒組的ALT和AST活性顯著性降低，與空白對照組和溶劑對照組相比較差異顯著(P<0.05)。目前的研究表明，TDCPP能夠引起大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶代謝紊亂，產(chǎn)生毒性反應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TDCPP能夠引起大鼠血清乙酰膽堿酯酶的活性降低，染毒組血清中乙酰膽堿酯酶的活力與空白對照組和溶劑對照組相比較顯著性降低(P<0.05)，且具有劑量依賴性，表明肝臟合成功能受損。

外源性化合物可以通過產(chǎn)生大量活性氧而造成對機(jī)體的損害，而機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶組成了防御過氧化系統(tǒng)，可清除活性氧、控制脂質(zhì)過氧化水平，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，TDCPP染毒8周后，大鼠血清中抗氧化酶SOD活性受到顯著性抑制，其中，高劑量染毒組最為顯著(P<0.01)。MDA是不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，作為抗氧化能力的重要指標(biāo)，其含量可以間接反映機(jī)體細(xì)胞的膜系統(tǒng)的氧化損傷程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著TDCPP染毒劑量的增加，大鼠血清中MDA的含量也顯著性增加(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TDCPP誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，造成氧化損傷。組織病理檢查的結(jié)果也表明，TDCPP可引起大鼠肝細(xì)胞損傷，主要表現(xiàn)為核固縮、線粒體損傷和炎癥細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TDCPP暴露8周后可損傷大鼠的肝臟功能，主要表現(xiàn)為TDCPP對大鼠肝臟的轉(zhuǎn)氨酶活性、血脂代謝和合成功能等造成了較為嚴(yán)重的破壞，同時(shí)對大鼠機(jī)體造成了嚴(yán)重的氧化損傷，且從4周和8周生化指標(biāo)對比來看，大鼠肝臟中毒程度在進(jìn)一步惡化。TDCPP的肝臟毒性損傷可能與其破壞肝臟轉(zhuǎn)氨酶功能，引起機(jī)體抗氧化系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加有關(guān)。本研究補(bǔ)充了TDCPP在哺乳類動(dòng)物肝臟毒性方面的數(shù)據(jù)，另外，本實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步檢測TDCPP對大鼠肝臟的損害程度，研究TDCPP是否能夠誘發(fā)肝臟相關(guān)的潛在疾病并揭示其引起肝臟損傷的機(jī)理[22]。