微囊藻毒素-LR對雄性黑斑蛙精巢中CYP46A1，CYP2H2和CYP2G1 mRNA表達的影響

劉正權，唐娟，劉文麗，蔣錦曉，杜瓊霞，李寧，張杭君,2，賈秀英,*

1. 杭州師范大學 生命與環(huán)境科學學院，杭州 310036 2. 杭州師范大學 生態(tài)系統(tǒng)保護與恢復杭州市重點實驗室，杭州 310036

藍藻水華產(chǎn)生的微囊藻毒素是全球性水環(huán)境污染物[1-4]。微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)是微囊藻毒素100多種異構體中，分布最廣泛和毒性最強的一種變體[5]。MC-LR主要通過抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1(serine/threonine protein phosphatase 1, PP1)和2A(serine/threonine protein phosphatase 2A, PP2A)，導致蛋白質(zhì)過磷酸化而引起毒效應。MC-LR可以在動物肝臟、腎臟、腸等多個組織中積累[6-7]，并造成毒性效應。也有許多研究表明，MC-LR會對動物精巢產(chǎn)生毒性效應。Chen等[8]表明MC-LR能導致雄性大鼠精巢中線粒體腫脹、細胞質(zhì)收縮、細胞膜空泡化、細胞核變形，破壞一些細胞支架相關基因的轉(zhuǎn)錄平衡，導致活性氧(ROS)產(chǎn)生和DNA損傷。Li等[9]證明MC-LR能引起大鼠精子質(zhì)量下降，破壞睪酮、促黃體生成素和促卵泡激素等的激素水平平衡，造成嚴重的生殖毒性。我們先前的研究也證明低劑量MC-LR體內(nèi)暴露會引起黑斑蛙精巢細胞凋亡、內(nèi)分泌干擾和精子質(zhì)量下降等生殖毒性效應[10-11]。黑斑蛙(Rananigromaculata)棲息于濕地，對環(huán)境污染物極其敏感[12]，而其主要生命過程與有毒藍藻水華發(fā)生時期相一致，因此很容易遭受MC-LR影響。目前，在精巢中，關于微囊藻毒素MC-LR對內(nèi)源性物質(zhì)的代謝作用及對微囊藻毒素MC-LR的代謝調(diào)節(jié)作用還不是很清楚，相關的生殖毒性分子機理有待進一步研究。

細胞色素P450是亞鐵血紅素的超家族蛋白酶，能催化多種反應，包括內(nèi)源性化合物(如類固醇、膽固醇、維生素D、膽酸等)和外源性化合物(如藥物、化學毒物、致癌物等)的代謝。其中，CYP46A1基因編碼的膽固醇24-羥化酶，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，能在大腦、精巢、眼睛和肝臟中表達。膽固醇24-羥化酶能催化大腦中膽固醇轉(zhuǎn)化為24S-羥化膽固醇，促使膽固醇穿過血液-大腦屏障[13]，進入血液循環(huán)，并在肝臟中進行分解代謝，使腦內(nèi)多余的膽固醇清除[14]。許多體外和體內(nèi)調(diào)查研究表明膽固醇24-羥化酶缺陷，能引起大腦中膽固醇代謝異常，引發(fā)阿爾茨海默病[13,15-16]；Burlot等[17]表明阿爾茨海默病樣tau病理模型小鼠與對照組相比，其海馬體的CYP46A1酶和24S-羥化膽固醇水平更低；Kuo等[18]研究發(fā)現(xiàn)高攝入膽固醇會引起大腦海馬體和皮質(zhì)中的膽固醇水平升高，產(chǎn)生明顯的認知障礙，并伴隨著的CYP46A1 mRNA表達水平和24S-羥化膽固醇水平顯著增加。因此，CYP46A1基因編碼的膽固醇24-羥化酶是一種涉及膽固醇平衡的代謝調(diào)節(jié)酶，一些病理引起的膽固醇平衡異常往往伴隨著膽固醇24-羥化酶水平的改變。然而，有研究表明，在精巢中存在血睪屏障的條件下，CYP46A1酶對精巢中膽固醇水平也具有調(diào)節(jié)作用[19]。膽固醇是性激素合成的重要底物[20]，精巢中的膽固醇代謝水平的異常影響性激素的合成[21]。因此，對CYP46A1轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)查研究，有助于闡明環(huán)境污染物干擾動物體精巢中膽固醇水平平衡，引起生殖毒性的分子機理，并利于評估該污染物的健康風險。而CYP2家族是已知的最大、最復雜的細胞色素P450家族，其活性的高低可間接反映多種環(huán)境污染物對生物體機體的毒性作用。有研究表明鎮(zhèn)靜劑苯巴比妥及相似化合物能誘導CYP2家族基因的表達[22]，包括CYP2H2和CYP2H1基因的表達。Hamilton等[23]表明，在雞胚肝細胞中，多種蛋白合成抑制劑(環(huán)已酰亞胺、鏈菌生素、乙酸環(huán)已基酰亞胺、密旋酶素和蓖麻毒素)能引起CYP2H2轉(zhuǎn)錄水平的增加。CYP2G1酶也能代謝外源性化合物[24]；具有解毒作用的Nrf2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)因子能激活CYP2G1轉(zhuǎn)錄[25]；當缺少Nrf2因子，CYP2G1的mRNA水平會減少。

我們通過基因克隆，已發(fā)現(xiàn)CYP46A1、CYP2H2和CYP2G1均能在黑斑蛙精巢中表達，克隆得到的Genebank基因序列號如表1所示。MC-LR引起的生殖毒性是否對CYP46A1、CYP2H2和CYP2G1轉(zhuǎn)錄水平存在作用尚不清楚，其毒性機理有待進一步研究。為此，我們探究了低劑量MC-LR(0、0.1、1和10 μg·L-1)在體內(nèi)暴露0、7和14 d后對黑斑蛙精巢組織中CYP46A1、CYP2H2和CYP2G1轉(zhuǎn)錄水平的影響，闡明低劑量MC-LR誘導這些基因轉(zhuǎn)錄水平變化的時間和劑量效應特征，為探索MC-LR的生殖毒性機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器設備

MC-LR(純度≥ 95%；Enzo Life Sciences公司，CAS No. 101043-37-2)，TRIzol?Plus RNA Purification Kit試劑盒(Invitrogen公司，美國，貨號：12183-555)，RNase-Free DNase Set試劑盒(Qiagen公司，德國，貨號：79254)，SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix試劑盒(Invitrogen Life Technologies公司，美國，貨號：11752-050)，Power SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒(Applied Biosystems公司，美國，貨號：4367659)。

DTH-2050R型高速冷凍離心機(上海德洋意邦儀器有限公司)，Nano-200型微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)，HH-2型恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司)，CFX384型多重實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物和實驗設計

健康成年雄性黑斑蛙(R.nigromaculata)購買自浙江長興創(chuàng)意生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，平均體長為(74.5±4.3) mm，平均體重為(36.6±9.8) g。在室內(nèi)盛有3 cm深的曝氣脫氯自來水(溫度：18～22 ℃；pH：6.0～7.0；溶解氧：6～8 mg·L-1)的玻璃水族缸(60 cm × 40 cm × 35 cm)中暫養(yǎng)7 d后，挑選健壯、規(guī)格整齊的黑斑蛙進行暴露試驗。

挑選的雄蛙隨機分成7組，每組20只，隨后分別暴露于深為3 cm的0、0.1、1和10 μg·L-1的MC-LR溶液。在這些實驗組中，有3組為空白組，分別暴露于脫氯自來水0、7和14 d，有2組暴露于1 μg·L-1MC-LR 7 d和14 d，另有2組分別暴露于0.1和10 μg·L-1MC-LR 14 d。該暴露實驗使用靜態(tài)置換法，每24小時更換MC-LR全部溶液，投喂蚯蚓(Eiseniafetida)2次，并提供自然光/暗周期暴露條件(14 h:10 h)。每組待暴露時間結束后，黑斑蛙分別以腦脊髓刺毀法處死。隨后取精巢組織，迅速用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline)沖洗2次，并放入冷凍管。冷凍管儲存于-80 ℃液氮中待測。所有動物處理程序符合實驗動物科學協(xié)會的指導方針。

1.3 mRNA分析

mRNA分析實驗之前，我們已對黑斑蛙精巢組織中的CYP46A1、CYP2H2和CYP2G1基因進行了基因克隆，得到基因序列，并把該基因序列提呈到了Genebank，得到Genebank的基因序列號，基因序列號見表1。精巢中總RNA采用TRIzol?Plus RNA Purification Kit試劑盒提取，并使用RNase-Free DNase Set試劑盒去除殘留的基因組DNA。通過紫外分光光度計(260/280 nm吸光度比值)和1%甲醛瓊脂糖凝膠電泳來測定總RNA的含量、純度及質(zhì)量。隨后，采用SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA。在cDNA的PCR擴增前，使用Primer Premier 6.0和Beacon Designer 7.8軟件設計引物，引物序列見表1。其次，使用CFX384多重實時熒光定量PCR儀進行二步法qRT-PCR的PCR擴增。qRT-PCR的反應體系為：8.0 μL無菌蒸餾水(SDW)，10.0 μL power SYBR?Green Master Mix (Applied Biosystems)，0.5 μL forward primers(10 μmol·L-1)，0.5 μL the reverse primers(10 μmol·L-1)和1.0 μL cDNA。qRT-PCR的反應體系為：95 ℃變性1 min，隨后進行40個熱循環(huán)(95 ℃、15 s，63 ℃、25 s，收集熒光)?；虮磉_通過比較的Ct(2-△△Ct)方法進行統(tǒng)計學分析，基因相對表達通過2-△△Ct計算，Ct代表循環(huán)閥值[26]。每個樣品做3次平行實驗。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列和條件Table 1 Real-Time PCR primers and conditions

圖1 CYP46A1、CYP2H2、CYP2G1和18S(內(nèi)參)的實時熒光定量PCR熔點曲線Fig. 1 The real-time PCR melt curve of CYP46A1, CYP2H2, CYP2G1 and 18S (control)

圖2 CYP46A1、CYP2H2、CYP2G1和18S(內(nèi)參)的實時熒光定量PCR熔點曲線Fig. 2 The real-time PCR amplification curve of CYP46A1, CYP2H2, CYP2G1 and 18S (control)

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，并使用Origin 8.5軟件進行統(tǒng)計分析。MC-LR暴露組與空白對照組的統(tǒng)計學差異通過單因素方差分析，隨后進行費雪最小顯著差異法(Fisher's least significant difference test)分析。*P< 0.05、**P< 0.01表示差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 CYP46A1、CYP2H2和CYP2G1這3種擴增基因特異性分析

在55～95 ℃，通過熔解曲線對擴增產(chǎn)物進行特異性分析。各基因的熔解曲線見圖1，擴增曲線見圖2。圖1和圖2的結果表明擴增得到的3種CYP基因產(chǎn)物均具有較好特異性。

2.2 MC-LR對黑斑蛙精巢中CYP46A1 mRNA表達的影響

CYP46A1基因編碼膽固醇24-羥化酶，對膽固醇平衡調(diào)節(jié)具有重要作用。圖3和圖4為MC-LR暴露后雄性黑斑蛙精巢中CYP46A1 mRNA表達變化。當黑斑蛙暴露于0.1、1和10 μg·L-1MC-LR溶液14 d后，精巢中CYP46A1的mRNA表達水平分別上調(diào)了1.86、1.65、1.22倍(圖3)。黑斑蛙暴露于1 μg·L-1MC-LR溶液7 d后，精巢中CYP46A1的mRNA表達水平上調(diào)了2.13倍(圖4)。結果表明，0.1 μg·L-1MC-LR暴露組精巢中CYP46A1表達強度最高，隨著MC-LR暴露濃度增加，CYP46A1的mRNA表達水平逐漸下降，說明MC-LR具有潛在的干擾精巢中膽固醇水平平衡和毒物低劑量興奮效應。

2.3 MC-LR對黑斑蛙精巢中CYP2H2 mRNA表達的影響

CYP2H2具有代謝外源性物質(zhì)的作用。圖5和圖6顯示MC-LR暴露后雄性黑斑蛙精巢中CYP2H2 mRNA表達變化。黑斑蛙暴露于0.1、1和10 μg·L-1MC-LR溶液14 d后，精巢中CYP2H2的mRNA表達水平分別上調(diào)了4.62、1.80和1.04倍(圖5)，其中在1 μg·L-1和10 μg·L-1MC-LR暴露下，CYP2H2 mRNA表達水平與對照組相比沒有顯著差異。暴露于1 μg·L-1MC-LR溶液7 d，黑斑蛙精巢中CYP2H2的mRNA表達水平上調(diào)了5.25倍(圖6)。上述結果同樣表明，低劑量MC-LR暴露會誘導CYP2H2的mRNA表達水平變化呈現(xiàn)毒物低劑量興奮效應。

圖3 低劑量微囊藻毒素-LR(MC-LR)對雄性黑斑蛙精巢中CYP46A1 mRNA表達的影響注：雄性黑斑蛙分別暴露于0、0.1、1和10 μg·L-1 MC-LR溶液14 d。柱狀圖表示平均值±標準偏差。*、**表示與對照組相比差異顯著(*P<0.05，**P<0.01)。Fig. 3 Effects of low dose microcystin-LR (MC-LR) on CYP46A1 mRNA expressions in testes of male frogsNote: Male frogs were respectively exposed to 0, 0.1, 1, and 10 μg·L-1 MC-LR for 14 d. Bars represented mean±S.D.. Asterisks denote significant differences when compared with the control (*P < 0.05, **P < 0.01).

圖4 低劑量MC-LR對雄性黑斑蛙精巢中CYP46A1 mRNA表達的影響注：雄性黑斑蛙分別暴露于1 μg·L-1 MC-LR溶液0、7和14 d。柱狀圖表示平均值±標準偏差。*、**表示與對照組相比差異顯著(*P<0.05，**P<0.01)。Fig. 4 Effects of low dose MC-LR on CYP46A1 mRNA expressions in testes of male frogsNote: Male frogs were respectively exposed to 1 μg·L-1 MC-LR for 0, 7 and 14 d. Bars represented mean±S.D.. Asterisks denote significant differences when compared with the control (*P<0.05, **P<0.01).

圖5 低劑量MC-LR對雄性黑斑蛙精巢中CYP2H2 mRNA表達的影響注：雄性黑斑蛙分別暴露于0、0.1、1和10 μg·L-1 MC-LR 14 d。柱狀圖表示平均值±標準偏差。*、**表示與對照組相比差異顯著(*P<0.05，**P<0.01)。Fig. 5 Effects of low dose MC-LR on CYP2H2 mRNA expressions in testes of male frogsNote: Male frogs were respectively exposed to 0, 0.1, 1, and 10 μg·L-1 MC-LR for 14 d. Bars represented mean±S.D.. Asterisks denote significant differences when compared with the control (*P<0.05, **P<0.01).

2.4 MC-LR對黑斑蛙精巢中CYP2G1 mRNA表達的影響

CYP2G1可參與Nrf2的解毒過程[25]。圖7和圖8顯示MC-LR暴露后雄性黑斑蛙精巢中CYP2G1 mRNA表達水平變化。當黑斑蛙暴露于0.1、1和10 μg·L-1MC-LR溶液14 d后，精巢中CYP2G1的mRNA表達水平分別上調(diào)了2.63、2.16和1.56倍(圖7)。當暴露于1 μg·L-1MC-LR溶液7 d后，黑斑蛙精巢中CYP2G1的mRNA表達水平上調(diào)了3.59倍(圖8)。結果表明，低劑量MC-LR暴露會誘導精巢中CYP2G1的mRNA表達水平變化，呈現(xiàn)毒物低劑量興奮效應。

圖7 低劑量MC-LR對雄性黑斑蛙精巢中CYP2G1 mRNA表達的影響注：雄性黑斑蛙分別暴露于0、0.1、1和10 μg·L-1 MC-LR 14 d。柱狀圖表示平均值±標準偏差。*、**表示與對照組相比差異顯著(*P<0.05，**P<0.01)。Fig. 7 Effects of low dose MC-LR on CYP2G1 mRNA expressions in testes of male frogsNote: Male frogs were respectively exposed to 0, 0.1, 1, and 10 μg·L-1 MC-LR for 14 d. Bars represented mean±S.D.. Asterisks denote significant differences when compared with the control (*P<0.05, **P<0.01).

圖8 低劑量MC-LR對雄性黑斑蛙精巢中CYP2G1 mRNA表達的影響注：雄性黑斑蛙分別暴露于1 μg·L-1 MC-LR溶液0、7和14 d。柱狀圖表示平均值±標準偏差。*、**表示與對照組相比差異顯著(*P<0.05，**P<0.01)。Fig. 8 Effects of low dose MC-LR on CYP2G1 mRNA expressions in testes of male frogsNote: Male frogs were respectively exposed to 1 μg·L-1 MC-LR for 0, 7 and 14 d. Bars represented mean±S.D.. Asterisks denote significant differences when compared with the control (*P<0.05, **P<0.01).

3 討論(Discussion)

細胞色素P450酶系常作為毒物毒性的生物學標志物，并廣泛應用于毒理學研究中。細胞色素P450酶系可以通過生物轉(zhuǎn)化親脂性有毒化合物，變成極性強的易溶物質(zhì)，使毒性物質(zhì)失活，易于排出體外，從而起到解毒作用。而CYP46A1對精巢中膽固醇平衡具有調(diào)節(jié)作用，能轉(zhuǎn)化膽固醇為24S-羥化膽固醇，促進膽固醇進入血液循環(huán)并進行分解代謝；其表達水平的變化也反映該精巢存在一定的病變。在本研究中，0.1、1和10 μg·L-1MC-LR暴露14 d均引起CYP46A1 mRNA水平的增加，同時1 μg·L-1MC-LR暴露7 d也能引起CYP46A1 mRNA水平的增加。該結果表明低劑量MC-LR的短期暴露會引起CYP46A1 mRNA表達顯著上升，促進精巢中的膽固醇代謝。有研究表明，CYP46A1表達上升會引起24S-羥基膽固醇含量升高，并伴隨著膽固醇合成減少[27-28]；氧化應激會轉(zhuǎn)變膽固醇代謝和CYP46A1轉(zhuǎn)錄活性[27-28]。相一致地，我們前期研究表明低劑量MC-LR會誘導雄性黑斑蛙精巢的氧化應激[10]。作為性激素合成的底物，精巢中膽固醇含量的減少，會引起性激素合成的減少，從而引起內(nèi)分泌干擾作用。因此，低劑量MC-LR的短期暴露會引起CYP46A1 mRNA表達顯著異常，膽固醇平衡被破壞，具有干擾性激素合成的風險；本結果也驗證了低劑量MC-LR暴露會引起黑斑蛙精巢的氧化應激和細胞凋亡，并闡明了其氧化應激和細胞凋亡的毒效應，與膽固醇平衡和CYP46A1基因表達水平之間的相關性等機理。

CYP2亞族成員在許多外源物的生物轉(zhuǎn)化中起著重要作用。為此，我們調(diào)查了CYP2H2和CYP2G1基因的轉(zhuǎn)錄水平。在研究中發(fā)現(xiàn)，0.1 μg·L-1MC-LR暴露14 d會顯著上調(diào)CYP2H2 mRNA表達，然而，1和10 μg·L-1的MC-LR暴露14 d，CYP2H2 mRNA表達與對照組相比，沒有顯著差異。1 μg·L-1MC-LR暴露7 d會顯著上調(diào)CYP2H2 mRNA表達水平。相對短時期低劑量的MC-LR暴露，CYP2H2 mRNA表達水平明顯高于相對長時間的高劑量MC-LR暴露。結果表明，0.1 μg·L-1MC-LR暴露14 d和1 μg·L-1MC-LR暴露7 d都會誘導CYP2H2 mRNA表達水平上調(diào)，促進CYP2H2酶對有毒的MC-LR的代謝。而在1和10 μg·L-1MC-LR的短期暴露后，會使CYP2H2 mRNA表達水平相對穩(wěn)定，降低精巢組織對MC-LR的代謝能力，導致MC-LR在精巢中蓄積而產(chǎn)生生殖毒性。另外，有研究表明，一些蛋白合成抑制劑能誘導CYP2H2 mRNA水平上調(diào)[23]。已有研究表明，MC-LR會引起細胞骨架相關基因轉(zhuǎn)錄水平的破壞和解毒物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)合成的減少[8,10]；并且MC-LR存在PP2A/PP1毒性，能使蛋白質(zhì)過磷酸化，引起靶組織病變[29]。這些毒性效應可能導致了精巢CYP2H2 mRNA水平上調(diào)。因此，該研究結果表明相對低劑量短時期的MC-LR暴露，會增強CYP2H2轉(zhuǎn)錄水平，進而利于MC-LR代謝，而相對高劑量的MC-LR暴露會使CYP2H2轉(zhuǎn)錄水平保持相對穩(wěn)定，不利于MC-LR的代謝，使MC-LR引發(fā)生殖毒性。

CYP2G1酶也屬于CYP2家族，對外源物質(zhì)有代謝作用。本實驗對CYP2G1的轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測，結果表明，0.1、1和10 μg·L-1MC-LR 14 d暴露均引起CYP2G1 mRNA水平的增加。1 μg·L-1MC-LR的7 d暴露也能引起CYP2G1 mRNA水平的增加。Wu等[25]的研究表明抵御外源性刺激和毒物的抗氧化應答反應核心轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的激活會引起CYP2G1 mRNA表達量上升。因此，研究結果表明低劑量MC-LR暴露會上調(diào)CYP2G1的轉(zhuǎn)錄水平，增強對MC-LR毒物的代謝。該代謝過程可能由解毒作用轉(zhuǎn)錄因子Nrf2激活，這需要后期進一步研究。