羥基多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)小鼠肝臟微粒體體外代謝及對(duì)雌激素代謝的影響研究

陳玫宏，徐懷洲，宋寧慧，張芹，張圣虎,*，李江

1. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042 2. 貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025

羥基多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)作為一類具有內(nèi)分泌干擾性質(zhì)的酚類化合物已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[1-3]。與母體多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)相比，具有更大的生物毒性效應(yīng)[4-5]，目前在環(huán)境介質(zhì)[6-8]、生物體[9-11]甚至人體[12-14]中均有檢出，表明OH-PBDEs具有一定的持久性。目前有研究表明，OH-PBDEs可以在生物體內(nèi)通過(guò)生物酶催化氧化進(jìn)一步形成一相代謝產(chǎn)物，代謝速率受溴原子數(shù)量及羥基、溴原子和醚鍵三者之間的位置等因素的影響[15-19]。

由于生物體內(nèi)雌激素的合成和代謝受多種因素的調(diào)節(jié)，外源性雌激素可能通過(guò)影響這些調(diào)節(jié)發(fā)揮其雌激素活性效應(yīng)[20-22]。目前研究表明OH-PBDEs在生物體內(nèi)能夠影響磺基轉(zhuǎn)移酶的生物活性[23-25]。細(xì)胞色素P450酶作為生物體內(nèi)重要代謝酶系，是維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)適當(dāng)17β-雌二醇(E2)水平的主要因素，Lai和Cai[26]發(fā)現(xiàn)OH-PBDEs對(duì)E2的代謝能夠產(chǎn)生非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

因此，本研究用小鼠肝微粒體對(duì)4種OH-PBDEs(5'-OH-BDE-99、6'-OH-BDE-99、6-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137)進(jìn)行體外代謝研究，并考察OH-PBDEs對(duì)雌激素包括雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α-炔雌醇(EE2)等代謝的影響，有助于更加全面的評(píng)價(jià)OH-PBDEs在生物體的代謝行為和毒性效應(yīng)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

AG-285電子天平(Mettle公司，瑞士)；Biofuge stratos高速冷凍離心機(jī)(Heraeus公司，德國(guó))；Avanti J-30I超高速離心機(jī)(Beckman Coulter公司，美國(guó))；Tecan Infinite 200酶標(biāo)儀(Tecan公司)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(INNOVA 43R，NBS公司)；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)(Kyoto公司，日本)；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity, MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國(guó))。

圖1 羥基多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)和雌激素的結(jié)構(gòu)圖注： 5'-OH-BDE-99為5’-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯(lián)苯醚，6'-OH-BDE-99為6’-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯(lián)苯醚，6-OH-BDE-99為6-羥基-2,2',3,4,4'-五溴聯(lián)苯醚，6-OH-BDE-137為6-羥基-2,2',3,4,4',5-六溴聯(lián)苯醚；E1為雌酮，E2為17β-雌二醇，E3為雌三醇，EE2為17α-炔雌醇。Fig. 1 Constructions of hydroxyl polybrominated diphenyl ethers (OH-PBDEs) and estrogensNote: 5'-OH-BDE-99 (5'-Hydroxy-2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether), 6'-OH-BDE-99 (6'-Hydroxy-2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether), 6-OH-BDE-99 (6-Hydroxy-2,2',3,4,4'-pentabromodiphenyl ether), 6-OH-BDE-137 (6-Hydroxy-2,2',3,4,4',5-hexabromodiphenyl ether); E1 (Estrone), E2 (17β-Estradiol), E3 (Estriol), EE2 (17α-Ethynylestradiol).

4種OH-PBDEs和4種雌激素(圖1)：5'-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯(lián)苯醚(5'-OH-BDE-99)、6'-羥基-2,2',4,4',5-五溴聯(lián)苯醚(6'-OH-BDE-99)、6-羥基-2,2',3,4,4'-五溴聯(lián)苯醚(6-OH-BDE-99)、6-羥基-2,2',3,4,4',5-六溴聯(lián)苯醚(6-OH-BDE-137)、雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α-炔雌醇(EE2)購(gòu)于百靈威科技有限公司(J&K公司)。

三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(Na2EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G250、7-乙氧基試鹵靈、試鹵靈、甘氨酸、7-乙氧基香豆素、7-羥基香豆素、鹽酸苯胺、4-氨基苯酚均購(gòu)于J&K公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)購(gòu)自Sigma Aldrich公司；甲醇和乙腈為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；氨水(色譜純)、二甲基亞砜(DMSO，藥檢專用)、氯化鉀和氫氧化鈉(分析純)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 肝微粒體的制備

無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)ICR小白鼠(約6周齡)購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。通過(guò)頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出肝臟，在冰浴中用冰冷的生理鹽水(0.9%)沖洗，濾紙拭干后稱重，剪碎后加入由20%甘油、0.15 mol·L-1KCl、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)、0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制而成的緩沖液(m(肝臟)∶V(緩沖液)=1∶3)，勻漿后以9 000 g(4 ℃)離心20 min。將所得上清液在105 000 g(4 ℃)下進(jìn)一步離心30 min，棄去上清液，淡紅色沉淀物即為肝臟微粒體。按單位肝臟重量(g)加0.5 mL重懸緩沖液(20%甘油、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1DTT，以0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制。制成勻漿，分裝后儲(chǔ)存于液氮中備用。用Bradford法測(cè)定微粒體蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[27]，以上步驟均在冰浴中進(jìn)行。

1.3 酶活性測(cè)定方法

乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性的測(cè)定方法[16,18]：反應(yīng)體系包括1 mg·mL-1牛血清蛋白(BSA)、1 mmol·L-17-乙氧基香豆素、微粒體樣品液，Tris-HCl緩沖液用于維持體系的pH值，整個(gè)反應(yīng)體系總體積為1 mL。37 ℃預(yù)熱5 min后加入NADPH開(kāi)啟反應(yīng)，反應(yīng)10 min后，添加三氯乙酸(15%)終止反應(yīng)。加入2 mL三氯甲烷萃取反應(yīng)產(chǎn)物，渦旋2 min后于3 000 g下離心5 min；隨后，取1 mL有機(jī)相加入5 mL 0.6 mol·L-1NaOH-甘氨酸緩沖液(pH 10.4)，渦旋萃取，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)7-羥基香豆素的吸光度值。酶活性最終用7-羥基香豆素的生成量表示，單位為pmol·min-1·mg-1。

1.4 OH-PBDE對(duì)微粒體活性影響

通過(guò)在NADPH存在下將小鼠肝臟微粒體與OH-PBDE一起孵育，分別考察不同濃度的OH-PBDE對(duì)小鼠肝臟微粒體CYP450的ECOD活性的影響。設(shè)定OH-PBDE在代謝體系中濃度為1.5、3、6、15、30μmol·L-1，于37 ℃條件下代謝2 h，終止反應(yīng)后，測(cè)定ECOD的活性，對(duì)照組不添加OH-PBDE。

1.5 體外代謝實(shí)驗(yàn)

1.5.1 OH-PBDEs的體外代謝

代謝反應(yīng)體系體積為2 mL(pH=7.4)，包含0.1 mol·L-1Tris-HCl、3μmol·L-1OH-PBDE、1 mg·mL-1微粒體，OH-PBDEs用DMSO助溶(反應(yīng)體系中DMSO比例為1%)。將反應(yīng)體系在37 ℃(120 r·min-1)恒溫震蕩器中預(yù)孵育5 min，然后加入輔酶NADPH啟動(dòng)反應(yīng)。NADPH的最終濃度為0.8 mg·mL-1，對(duì)照組不含輔酶。孵育2 h后，加入2 mL冰乙腈終止反應(yīng)，放入-20 ℃冰箱20 min后，取上清液過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，待HPLC-MS/MS測(cè)定目標(biāo)物的濃度。4種OH-PBDEs單獨(dú)進(jìn)行體外代謝實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)平行，一個(gè)對(duì)照組，并根據(jù)代謝反應(yīng)結(jié)束時(shí)OH-PBDEs的濃度與零時(shí)刻濃度比值計(jì)算代謝率。

1.5.2 OH-PBDEs對(duì)雌激素體外代謝影響

分別將4種OH-PBDEs添加到含2.7μmol·L-1雌激素的代謝體系中進(jìn)行代謝影響研究。代謝反應(yīng)體系體積為2 mL，包含0.1 mol·L-1Tris-HCl、1.5～6(1.5、3、6)μmol·L-1OH-PBDE、2.7μmol·L-1雌激素(E1、E2、E3、EE2)、1 mg·mL-1微粒體，加入輔酶NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃下分別振蕩培養(yǎng)2 h，每組設(shè)置3組平行，對(duì)照組不含OH-PBDEs。代謝反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入2 mL冰乙腈，放入-20 ℃冰箱20 min后，取上清液過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜后測(cè)定雌激素的含量，并根據(jù)代謝反應(yīng)結(jié)束時(shí)雌激素的含量與零時(shí)刻含量比值計(jì)算代謝率。

1.6 儀器分析1.6.1 OH-PBDEs的測(cè)定

樣品測(cè)定采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)：質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ESI-)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)，負(fù)離子模式，離子源溫度500 ℃，離子噴霧電壓4 500 V，氣簾氣壓力206 851.8 Pa，噴霧氣壓力241 327.1 Pa，輔助加熱氣壓力275 802.4 Pa；色譜條件為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm × 2.1 mm, 3.5μm)，OH-PBDEs測(cè)定的流動(dòng)相為0.2% (V/V)氨水(A)和乙腈(B)，A與B的比例為3:7(V/V)，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積5μL，外標(biāo)法定量。具體參數(shù)見(jiàn)表1。4種OH-PBDEs均在1～100μg·L-1范圍內(nèi)線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9789，定量限(LOQ)范圍為0.01～1.03μg·L-1，回收率范圍為65%～116%。

1.6.2 雌激素及其產(chǎn)物的測(cè)定

4種雌激素及產(chǎn)物2-羥基雌二醇(2-OH-E2)采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)進(jìn)行檢測(cè)分析。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ESI-)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)，負(fù)離子模式，離子源溫度400 ℃，離子噴霧電壓4 500 V，氣簾氣壓力206 851.8 Pa，噴霧氣壓力241 327.1 Pa，輔助加熱氣壓力275 802.4 Pa；色譜條件為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm × 2.1 mm，3.5μm)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，A與B的比例為3:7(V/V)，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積5μL，外標(biāo)法定量，其他具體參數(shù)見(jiàn)表2。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本文所有結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。采用SPSS19.0和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(單因素方差分析，Dunnett’s T3(3))，對(duì)各處理組與對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著(*)。

表1 4種OH-PBDEs的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometric conditions of four OH-PBDEs

注：*為定量離子。

Note: * represents quantitative ions.

表2 4種雌激素及產(chǎn)物的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometric conditions of four estrogens and products

注：*定量離子; 2-OH-E2表示2-羥基雌二醇。

Note: * represents quantitative ions; 2-OH-E2 stands for 2-hydroxyestradiol.

圖2 不同濃度的OH-PBDEs對(duì)7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性的影響注：CK表示未添加OH-PBDEs時(shí)，孵育2 h后ECOD活性； *表示與對(duì)照相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Effect of OH-PBDEs at different concentrations on the 7-ethoxycoumarin-O-deethylase (ECOD) activityNote: CK indicates ECOD activity after 2 h incubation without OH-PBDEs; * indicates significant difference (P<0.05), compared with CK.

圖3 OH-PBDEs與孵育時(shí)間的關(guān)系Fig. 3 Concentrations of OH-PBDEs as a function of incubation time

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 OH-PBDEs對(duì)ECOD活性的影響

由于ECOD可以表征CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B1、CYP2B6、CYP2E1等多種CYP450酶亞系的活性，因此ECOD活性一般可以作為表征CYP450總活性的指標(biāo)。

在未添加OH-PBDEs時(shí)，微粒體孵育2 h后ECOD活性為(2 500±43) pmol·min-1·mg-1protein。不同OH-PBDEs濃度下ECOD活性結(jié)果如圖2所示，隨著反應(yīng)體系中OH-PBDEs濃度的增加，5'-OH-BDE-99在低濃度(1.5μmol·L-1)下顯著促進(jìn)ECOD活性(P<0.05)，其余濃度條件下與對(duì)照相比不存在顯著性差異；6-OH-BDE-99隨濃度的增加降低了ECOD活性，但是與對(duì)照相比不存在顯著性差異；6-OH-BDE-137在低濃度(1.5μmol·L-1)下對(duì)ECOD活性無(wú)顯著影響，但是隨著濃度的增加顯著促進(jìn)ECOD活性，與對(duì)照相比存在顯著性差異(P<0.05)；6'-OH-BDE-99隨濃度的增加，對(duì)ECOD活性的影響不明顯。由此可見(jiàn)，4種OH-PBDEs對(duì)微粒體ECOD活性存在不同作用。

2.2 OH-PBDEs的體外代謝

圖3為4種OH-PBDEs的代謝率隨孵育時(shí)間的變化圖。由圖3可以看出，隨孵育時(shí)間的增加，4種OH-PBDEs的代謝率逐漸增大，在100 min左右達(dá)到最高，反應(yīng)結(jié)束時(shí)基本達(dá)到平衡位置，其中6-OH-BDE-99代謝率最大，為85.9%，其他3種OH-PBDEs(5’-OH-BDE-99、6’-OH-BDE-99、6-OH-BDE-137)的代謝率分別為46.0%、64.3%、53.9%。

研究表明，溴原子數(shù)量會(huì)影響OH-PBDEs的代謝，Li等[16]用豬肝微粒體體外代謝3種OH-PBDEs (3’-OH-BDE-7、4’-OH-BDE-17和3-OH-BDE-47)，發(fā)現(xiàn)代謝率隨溴原子數(shù)量的增加而降低。Lai和Cai[26]用大鼠肝微粒體體外代謝11種OH-PBDEs，發(fā)現(xiàn)溴原子含量較多的6-OH-BDE-137代謝率最小，這與本研究結(jié)論一致(6-OH-BDE-137<6-OH-BDE-99)。此外，對(duì)于溴原子數(shù)量相同的3種五溴OH-PBDEs，醚鍵與羥基(OH)官能團(tuán)及溴原子互為鄰位時(shí)代謝率最高，表明醚鍵、OH官能團(tuán)和溴原子的相對(duì)位置對(duì)代謝有重要影響，這與Lai和Cai[26]以及本實(shí)驗(yàn)室[18]前期研究結(jié)論一致。

2.3 OH-PBDEs對(duì)雌激素體外代謝的影響

4種不同濃度OH-PBDEs對(duì)雌激素代謝影響見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，除EE2外(代謝率91.0%)，4種OH-PBDEs不同濃度下對(duì)其余3種雌激素(E1、E2和E3)代謝具有不同影響。與未添加OH-PBDEs的空白對(duì)照組相比(52.3%)，5’-OH-BDE-99在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的低濃度時(shí)對(duì)E1代謝無(wú)影響，但是隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加，對(duì)E1代謝表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)；6’-OH-BDE-99和6-OH-BDE-99在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的低濃度時(shí)具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，但隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加，對(duì)E1代謝的促進(jìn)作用逐漸降低；6-OH-BDE-137在實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度下對(duì)E1代謝無(wú)影響。

E2與E1的代謝率接近，為47.1%。與未添加OH-PBDEs的空白對(duì)照組相比，5’-OH-BDE-99隨實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加略有降低，但是無(wú)顯著性影響；其余3種OH-PBDEs在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的低濃度時(shí)對(duì)E2代謝具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，但隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加，6’-OH-BDE-99對(duì)E2代謝的促進(jìn)作用逐漸降低，并在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的高濃度時(shí)表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，而6-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加促進(jìn)作用略有降低，但仍表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。目前，OH-PBDEs對(duì)雌激素代謝的影響的研究報(bào)道較少，Lai和Cai[26]研究了BDE 47、6-CH3O-BDE-47和2種OH-PBDEs(2’-OH-BDE-28和3’-OH-BDE-100)在濃度范圍0.9～412.0μmol·L-1內(nèi)對(duì)E2代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)母體BDE 47和甲氧基6-CH3O-BDE-47，2種OH-PBDEs更能夠顯著抑制E2的代謝，而且對(duì)E2代謝表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。與本研究結(jié)果不同，這可能與OH-PBDEs的結(jié)構(gòu)以及設(shè)置濃度有關(guān)，對(duì)生物體內(nèi)E2代謝的差異可能源于OH-PBDEs對(duì)本身代謝體系酶活性的影響所致，有待于進(jìn)一步研究。

E3的代謝率相對(duì)較低，僅為16.9%，這可能是由于E3作為E2的代謝物，生物利用性相對(duì)較低[28]。與未添加OH-PBDEs的空白對(duì)照組相比，5’-OH-BDE-99、6’-OH-BDE-99和6-OH-BDE-99對(duì)雌激素代謝影響表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的低濃度時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，且隨著OH-PBDEs濃度的增加，促進(jìn)作用逐漸增加，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的高濃度時(shí)具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)；6-OH-BDE-137與上述3種OH-PBDEs對(duì)E3代謝的影響略有不同，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的低濃度時(shí)對(duì)E3代謝具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，但隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加，6’-OH-BDE-137對(duì)E3代謝的促進(jìn)作用逐漸降低。

圖4 不同濃度OH-PBDEs對(duì)雌激素代謝的影響注：CK表示未添加OH-PBDEs時(shí)，孵育2 h后雌激素的代謝率；*表示與對(duì)照相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 4 Effects of different concentrations of OH-PBDEs on metabolism of estrogensNote: CK indicates metabolic rate of estrogen after 2 h incubation without OH-PBDEs; * indicates significant difference (P<0.05), compared with CK.

由于不同的雌激素是由不同的酶催化[25]，Kester等[24]報(bào)道了OH-PBDEs對(duì)E2磺基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用，導(dǎo)致E2硫酸化降低和內(nèi)源性雌激素的生物利用度增加。因此不同結(jié)構(gòu)和濃度的OH-PBDEs對(duì)E1、E2、E3代謝產(chǎn)生的不同效應(yīng)，在一定程度上說(shuō)明外源性物質(zhì)可能對(duì)代謝雌激素的生物酶的活性位點(diǎn)產(chǎn)生作用，進(jìn)而影響其代謝，但是具體如何影響將進(jìn)一步研究。

雌激素的代謝途徑較為復(fù)雜，最常見(jiàn)的有2、6α、6β、15α、16α羥基化，17β羥基脫氫氧化以及3-羥基硫酸酯化[29]。為了進(jìn)一步研究OH-PBDEs對(duì)雌激素代謝的影響，以E2為代表定量表征其代謝產(chǎn)物生成量，由于2-OH-E2是E2在I相酶中的主要代謝產(chǎn)物之一，能夠評(píng)估外源性化合物對(duì)E2代謝的抑制[30]，因此，本研究利用外標(biāo)法定量測(cè)定了E2代謝產(chǎn)物2-OH-E2的生成量，結(jié)果見(jiàn)表3。與未添加OH-PBDEs的空白對(duì)照相比，5’-OH-BDE-99能夠抑制2-OH-E2的生成量，但是隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加，抑制作用無(wú)明顯差異；其余3種OH-PBDEs在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的低濃度時(shí)對(duì)2-OH-E2的生成量具有促進(jìn)作用，但隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加，6’-OH-BDE-99和6-OH-BDE-137抑制了2-OH-E2的生成量，且6-OH-BDE-137抑制能力更強(qiáng)，而6-OH-BDE-99隨著實(shí)驗(yàn)添加濃度的增加促進(jìn)作用反而增加，這表明OH-PBDEs的不同暴露水平對(duì)2-OH-E2的生成量存在差異，也間接表明對(duì)E2代謝途徑的影響不同，有待于進(jìn)一步研究。