MicroRNA-34a對小鼠氣道平滑肌細胞增殖和ORMDL3表達的影響

趙龍，王寧，石曉嵐，劉翠翠

（陜西省西安市兒童醫(yī)院 呼吸哮喘科，陜西 西安 710003）

支氣管哮喘疾病是由多種炎癥細胞、免疫細胞，以及多種細胞因子作用于肺氣道的常見慢性疾病[1-2]。調查顯示，近年全球兒童哮喘發(fā)病率持續(xù)上升[3]。血清類黏蛋白1樣蛋白3（orosomucoid1-like protein 3，ORMDL3）基因位于17q21，被MOFFATT等[4]首次發(fā)現(xiàn)并確定為兒童哮喘新的候選基因，此后集中于兒童哮喘的研究[5]。大量研究顯示，ORMDL3轉基因小鼠能夠增加氣道重塑和氣道反應等重要的哮喘病理特征，而該過程可能與microRNA（miRNA）的調控關系密切[6-7]。miRNA是一種非編碼短鏈RNA，可調控多種生物學過程[8]。研究顯示，大量miRNA對哮喘疾病引起的氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMC）和肥大細胞異常增殖具有調節(jié)作用，如miR-10a和miR-133a通過調控其靶基因影響ASMC的增殖[9-10]。miR-34a可參與調節(jié)多種平滑肌細胞增殖[11]。SHIN等[12]發(fā)現(xiàn)，結節(jié)性硬化癥相關基因TSC1通過抑制miR-34a水平參與調控哮喘疾病，然而miR-34a對ASMC增殖的調控仍然未知。本文旨在探索miR-34a對ASMC增殖和ORMDL3表達水平的調控效應及機制，為哮喘發(fā)病機制的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年雌性小鼠[上海斯萊克實驗動物中心，無特定病原體級別，SCXK（滬）2015-0001]，ASMC（美國Cambrex Bioscience公司），卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁 Al（OH）3購自美國 Sigma公司，miR-34a-mimic、miR-34a-mimic購自上海吉瑪制藥技術有限公司，壓縮式霧化吸入器（德國PARI有限公司），MTT細胞增殖檢測試劑盒（美國Trevigen公司），Dharma FECT 1 Transfection Reagent（美國 Thermo Scientific公司），MTT試劑（廣州新視野生物科技有限公司），miR Neasy mini試劑盒、miScript 逆轉錄試劑盒購自德國Qiagen公司，M-MLV逆轉錄酶（美國Clontech公司），SYBR Green Master Mix（美國生命國際科技有限公司），聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒、anti-ORMDL3、anti-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 動物模型的復制與分組

小鼠體重22～38 g，共90只進行OVA誘導，復制哮喘模型[13]。動物處理分為4組：①OVA組（30只）注射后1、7和14 d每只小鼠左下腹腔注射2.5 mg Al（OH）3+25μg OVA的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（250μl），21 ～ 27d用100ml 2%OVA進行氣道霧化；②對照組（15只）1、7和14 d每只小鼠左下腹腔注射250μl PBS；③miR-34amimic組（30只）基礎處理同模型組，并于21～27 d左下腹腔注射50 nmol/50μl miR-34a-mimic，1次/d；④miR-34a-mimic-NC組（15只）左下腹腔注射50 nmol/50μl miR-34a-mimic-NC，1次 /d。

1.3 蘇木精-伊紅染色

取28 d小鼠肺組織固定于10%多聚甲醛，用石蠟包埋，制作石蠟切片，厚5μm，用常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色并觀察肺部氣道組織病理學改變。

1.4 ASMC培養(yǎng)

ASMC的培養(yǎng)嚴格按照試劑盒說明書進行操作。將凍存的ASMC細胞于37℃溫水浴融化進行復蘇。500 r/min離心5 min，加10 ml含1%青鏈霉素、1%谷氨酰胺、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并置于37℃、5%二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱中。每隔3 d換液1次，待細胞生長至融合率達80%后用0.25%胰酶消化，進行傳代，用于后續(xù)指標檢測。

1.5 MicroRNA寡核苷酸的瞬時轉染

ASMC按2×107個細胞/孔的密度接種于6孔板，細胞融合率達60%時，使用Dharma FECT 1試劑盒轉染25 nmol miR-34a-mimic或者對應的陰性對照組miR-34a-mimic-NC處理72 h，隨后用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miR-34a的表達，驗證轉染效率。

1.6 ASMC增殖實驗

MTT法檢測細胞活力，經(jīng)過轉染的細胞接種于96孔培養(yǎng)板，密度為5×103個/孔。細胞在接受轉染后的72 h進行MTT試劑孵育，孵育條件為37℃、4 h。隨后加入二甲基亞砜溶解形成的甲瓚，使用Aspectrophotometer系統(tǒng)檢測490 nm下的吸光值。

1.7 qRT-PCR

細胞或者組織進行裂解后，使用miR Neasy mini試劑盒抽提總RNA，抽提過程嚴格按照試劑盒說明書進行。采用M-MLV逆轉錄酶將cDNA逆轉錄合成mRNA。用miScript逆轉錄試劑盒逆轉錄合成miRNA。采用SYBR Green Master Mix對基因表達水平進行定量。采用GAPDH對mRNA的相對表達結果進行標準化處理，用U6對miRNA進行標準化處理，表達水平相對倍數(shù)關系和顯著性分析用2-ΔΔCt法計算。見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot檢測

對28 d大鼠氣道組織或被轉染72 h的ASMC使用裂解緩沖液（0.5% v/v Nonidet P-40，50）進行裂解，使用BCA蛋白檢測試劑盒對總蛋白濃度進行檢測，并且統(tǒng)一濃度為6μg/μl。用10μl蛋白進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳分離后用聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進行濕轉。37℃、5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗（anti-ORMDL3，1∶600）孵育，4℃過夜。用TBST清洗3次，10 min/次。PVDF膜經(jīng)辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶18 000）室溫孵育1.5 h，使用化學發(fā)光增強系統(tǒng)對膜進行曝光。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件（美國Media Cybernetics公司）測量光密度，并使用內參蛋白GAPDH進行標準化處理。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OVA誘導氣道平滑肌層異常增殖

首先觀察OVA對肺部結構的影響，HE染色結果表明，OVA誘導雌性小鼠的肺部結構改變明顯。對照組肺部結構正常，平滑肌層厚度均勻，上皮細胞排列整齊。OVA組結果顯示，氣道平滑肌層加厚，上皮細胞排列紊亂，肺部結構明顯異常。表明OVA可誘導小鼠氣道組織平滑肌層異常增生。見圖1。

2.2 OVA誘導氣道組織ORMDL3表達上調并抑制miR-34a水平

ORMDL3在哮喘中扮演重要角色，第28天，OVA組ORMDL3 mRNA和蛋白的相對表達量分別為（4.562±0.481）和（4.064±0.598），對照組ORMDL3 mRNA和蛋白的相對表達量分別為（1.001±0.249）和（0.999±0.140），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.104和12.224，均P=0.000），與對照組比較OVA組ORMDL3的相對表達上調。見圖2。

通過生物信息學分析，初步篩選并檢測在第28天可能調控ORMDL3表達的9種miRNA，包括miR-1、miR-20、miR-34a、miR-34b-5p、miR-34c、miR-106a、miR-133a、miR-302及miR-449。OVA組miR-34a表達水平與對照組比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），OVA組低于對照組。而OVA組miR-1、miR-20、miR-34b-5p、miR-34c、miR-106a、miR-133a、miR-302及miR-449的表達水平與對照組比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2和圖3。

2.3 miR-34a-mimic減少氣道平滑肌層的增殖與ORMDL3的高表達

將焦點放在被OVA顯著抑制的miR-34a，從第21天開始連續(xù)7 d在左下腹腔注射miR-34a-mimic，HE染色觀察小鼠氣道組織變化。與miR-34a-mimic-NC組相比，miR-34a-mimic組小鼠氣道平滑肌層的異常增殖明顯減緩。見圖4。

圖1 小鼠肺組織 （HE×400）

圖2 氣道組織中ORMDL3的表達變化 （n =6，±s）

表2 OVA與對照組小鼠氣道組織中miRNA的表達水平比較 （n =6，±s）

表2 OVA與對照組小鼠氣道組織中miRNA的表達水平比較 （n =6，±s）

組別 miR-1 miR-20 miR-34a miR-34b-5p miR-34c miR-106a miR-133a miR-302 miR-449對照組 1.001±0.013 1.000±0.108 1.000±0.051 1.000±0.121 1.000±0.064 1.000±0.093 1.001±0.086 1.000±0.048 1.001±0.039 OVA 組 1.264±0.281 1.021±0.253 0.188±0.121 1.011±0.012 0.983±0.110 1.252±0.229 1.137±0.117 0.992±0.131 1.044±0.134 t值 1.294 0.043 -12.619 0.027 -0.435 2.017 1.795 -0.02 0.057 P值 0.225 0.981 0.000 0.994 0.983 0.071 0.103 0.985 0.956

圖3 氣道組織中miRNA的相對水平變化（n =6，±s）

對照組、OVA組、miR-34a-mimic-NC組 及miR-34a-mimic組的ORMDL3 mRNA表達量分別為（1.002±0.132）、（6.242±0.705）、（6.120±0.146）和（2.810±0.249），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=488.606，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，miR-34a-mimic組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-28.089，P=0.000）；而OVA組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.415，P=0.687）。因此，ORMDL3的高水平表達可被miR-34a-mimic減弱。見圖5。

圖4 miR-34a過表達處理的肺組織 （HE×400）

對照組、OVA組、miR-34a-mimic-NC組 及miR-34a-mimic組的ORMDL3蛋白表達量分別為（1.001±0.012）、（5.238±0.217）、（5.481±0.852）和（1.983±0.113），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.350，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，miR-34a-mimic組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-9.969，P=0.000）；而OVA組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.677，P=0.514）。結果表明，ORMDL3的高水平表達可被miR-34a-mimic減弱。見圖5。

圖5 各組氣道組織中ORMDL3 mRNA和蛋白表達水平比較

2.4 miR-34a-mimic抑制ASMC活性與ORMDL3的表達

體外培養(yǎng)ASMC細胞并轉染miR-34a-mimic或miR-34a-mimic-NC，測得對照組、miR-34amimic組及miR-34a-mimic-NC組的miR-34a相對表達水平分別為（1.004±0.183）、（8.315±0.282）和（1.002±0.092），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=1322.616，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，miR-34a-mimic組分別與對照組、miR-34amimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=53.271和60.389，均P=0.000）；而對照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.024，P=0.981）。表明miR-34a-mimic成功使miR-34a過表達。見圖6。

對照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34amimic組490 nm下的吸光值分別為（1.347±0.132）、（1.363±0.047）和（0.794±0.053），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=84.103，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，miR-34a-mimic組分別與對照組和miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.523和19.675，均P=0.000）；而對照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.280，P=0.785）。因此，miR-34a可抑制ASMC細胞490 nm下的吸光值。見圖6。

對照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34amimic組的細胞活性率分別為（100.034±2.582）、（100.243±9.251）和（68.982±13.243）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=44.785，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，miR-34a-mimic組分別與對照組和miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.637和4.740，均P=0.000）；而對照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=0.053，P=0.959）。結果表明，miR-34a可抑制ASMC細胞的活性。見圖6。

在培養(yǎng)的ASMC中，對照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34a-mimic組的ORMDL3 mRNA表達水平分別為（0.998±0.123）、（1.131±0.082） 和（0.232±0.101），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=2328.823，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，miR-34a-mimic組分別與對照組和miR-34amimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.789和16.927，均P=0.000）；而對照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=2.204，P=0.052）。因此，miR-34a可以抑制ASMC的增殖活性，并下調ORMDL3基因的表達。見圖7。

在培養(yǎng)的ASMC中，對照組、miR-34a-mimic-NC組及miR-34a-mimic組的ORMDL3蛋白表達水平分別為（1.001±0.032）、（1.014±0.053）和（0.254±0.006），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=876.739，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，miR-34a-mimic組分別與對照組和miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=56.201和34.902，均P=0.000）；而對照組與miR-34a-mimic-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=0.514，P=0.618）。結果表明，miR-34a可以抑制ASMC的增殖活性，并下調ORMDL3基因的表達。見圖7。

圖6 miR-34a-mimic抑制ASMC增殖 （n =6，±s）

圖7 各組ASMC細胞中ORMDL3 mRNA和蛋白表達水平比較

3 討論

ASMC的功能性失調是支氣管哮喘的關鍵因素，對該功能失調的內在分子與細胞機制仍無統(tǒng)一認識。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能調控ORMDL3基因表達并參與介導哮喘ASMC功能。本實驗結果顯示，在OVA誘導和刺激下小鼠的氣道組織中miR-34a的表達下降。以往研究表明，miRNA可通過自身水平的改變，參與哮喘動物模型氣道和平滑肌層功能的調控，miR-10a可以通過調控其靶基因PI3KCA促進ASMC增殖[9]，miR-133a通過調節(jié)靶向調控IL-13，從而影響Ras同源基因家族成員A（ras homolog gene family member A，RhoA）的表達，并且RhoA的表達增加能夠參與平滑肌的收縮調節(jié)[10]。miR-1在肌肉生理功能中扮演重要角色。研究表明，下調miR-1可以調節(jié)哮喘疾病過程中的平滑肌肥大[14]。miR-155敲除小鼠表現(xiàn)出迅速地氣道重塑和平滑肌細胞中的膠原沉積[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA誘導的小鼠氣道組織中miR-1、miR-133a有微弱上調趨勢。但是引人注目的是，miR-34a表達下調明顯，說明在哮喘小鼠氣道組織中miR-34a可能具有潛在調控作用。大量研究表明，miR-34a可調控多種細胞功能，如抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲能力[16]，以及平滑肌細胞增殖、遷移能力[11]。另外SHIN等[12]發(fā)現(xiàn)，結節(jié)性硬化癥相關基因TSC1通過抑制miR-34a水平參與調控哮喘疾病，并顯著抑制肥大細胞的增殖和活力。與上述結果一致，本研究的結果顯示，過表達miR-34a可抑制哮喘小鼠氣道平滑肌層的異常增殖和ASMC的增殖。以上結果說明，miR-34a能夠在包括哮喘在內的多種病理過程中，抑制多種細胞的增殖和活力。

自首次報道后，ORMDL3被大量用于兒童期哮喘疾病的研究，ORMDL3亦可在胎兒及成人的組織中表達[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠哮喘模型中過表達ORMDL3，可增加哮喘氣道組織病理性重塑，包括平滑肌細胞增殖增加、上皮下纖維化及黏液分泌加重[7]。TONCHEVA等[17]發(fā)現(xiàn)，ORMDL家族基因，包括ORMDLL1、ORMDL2及ORMDL3在哮喘患者平滑肌細胞中明顯上調，然而單核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，ORMDL3是其中最主要的影響因素。本研究獲得類似的結果，即在OVA的誘導下，ORMDL3在氣道組織的表達上調。然而，該上調趨勢被過表達miR-34a抑制。近年來大量研究表明，miRNA可通過抑制靶基因直接或間接調控各種蛋白表達，從而發(fā)揮不同的生理功能[8]，且miRNA參與調控哮喘引起的ASMC增殖等過程與ORMDL3的功能密不可分[7，18]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的ASMC中miR-34a過表達可抑制ORMDL3的表達。以上結果表明，在體內外的ASMC中，ORMDL3水平均可被miR-34a抑制。

綜上所述，過表達miR-34a可緩解哮喘小鼠ASMC異常增殖和抑制ORMDL3的高表達；另外miR-34a可抑制AMSC細胞的增殖，并且降低AMSC中ORMDL3水平。結果表明，哮喘致氣道平滑肌層功能異常的內在機制可能與miR-34a調節(jié)ORMDL3水平變化相關。然而，miR-34a是否對ORMDL3進行直接調控，仍需進一步深入研究。

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