CO2加富對魁蚶稚貝潛沙能力和3種酶活性的影響?

王為民， 張?zhí)煳模?劉光興， 陳洪舉**， 毛雪微

(1. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100； 2. 國家海洋局第一海洋研究所海洋氣候研究中心，山東 青島 266061；3. 山東省海水養(yǎng)殖研究所，山東 青島 266002； 4.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100)

在過去的250年里，由于化石燃料燃燒、森林砍伐和其他人類活動，大氣CO2平均濃度從工業(yè)革命前的280 μatm[1-2]升高到現(xiàn)在的395.26 μatm(NOAA, 2014)。大氣CO2濃度的升高造成海水pCO2升高、pH值降低和碳化學平衡改變，導致海洋酸化現(xiàn)象[1,3-4]。海洋酸化將會影響海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡，影響海洋雙殼類的生長發(fā)育和代謝[5-10]。

除了對貝類酶活性等生理活動造成影響，海洋酸化還會對其潛沙等行為活動產(chǎn)生影響。雙殼類生物幼體營附著生活，具有潛沙的特性。研究發(fā)現(xiàn)魁蚶稚貝生活環(huán)境(如溫度等)的變化將顯著影響魁蚶稚貝的潛沙過程[15]。海洋貝類對潛沙行為的調(diào)控是其適應(yīng)環(huán)境變化的表現(xiàn)。關(guān)于CO2濃度升高導致的海洋酸化對貝類酶活性和潛沙行為影響的研究報道較少且機理不明。

魁蚶(Scapharcabroughtonii, Schrenck, 1876)在中國分布廣泛且其經(jīng)濟價值較高，是我國出口換匯率較高的水產(chǎn)品之一，在中國北方沿海地區(qū)開展的人工繁育和養(yǎng)殖試驗取得了很大的成就[16]。未來海洋酸化導致的海水CO2濃度升高可能會對魁蚶養(yǎng)殖業(yè)造成不利影響，而雙殼類早期生長階段相比成體對CO2濃度升高更為敏感[17-18]。因此，開展高CO2濃度條件對魁蚶早期發(fā)育階段的影響研究非常重要。本文采用CO2加富培養(yǎng)的方法，研究了高CO2濃度條件對魁蚶稚貝殼長、潛沙過程和3種酶(SOD、CAT和AChE)活性的影響，以期為揭示海洋酸化對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魁蚶稚貝(平均殼長(17.20 ± 0.03) mm)由山東海水養(yǎng)殖研究所提供，在實驗室暫養(yǎng)于連續(xù)充氣(DO>5.5 mg/L)的若干個水族箱(40 cm×35 cm×15 cm；溫度20 ℃；鹽度30)內(nèi)，暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)和實驗期間魁蚶稚貝每天喂食1次，喂食餌料為球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和三角褐指藻(Phacodactylumtricornutum)的混合藻液，保持培養(yǎng)水體藻細胞濃度小于105cells/L。

1.2 CO2加富對魁蚶稚貝潛沙過程的影響

30 cm×20 cm×15 cm規(guī)格的水族箱內(nèi)底部鋪設(shè)4～5 cm中砂(取自青島金沙灘)，裝入其容積約2/3體積的膜濾(GF/C 0.45 μm)滅菌(121 °C, 15 min)海水，并分別泵入過濾自然空氣(395 μatm CO2，2014年全球大氣CO2濃度平均水平)和含1 000 μatm CO2(2010年大氣平均CO2濃度預測水平)的過濾混合空氣，作為對照組和CO2組。通氣流量控制在0.1 L·min-1，CO2濃度和通氣流量由CO2加富器(CE100-6型，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責任公司)控制。

于每個水族箱沙層(4～5 cm)表面自然放置魁蚶稚貝40只，觀察稚貝的潛沙行為，記錄稚貝的初潛時間(min)及1 h潛沙率。初潛時間為第1只魁蚶稚貝潛沙的時間，潛沙標準為魁蚶稚貝貝殼一半以上埋入沙中；潛沙率(%)=已潛沙個體數(shù)/總個體數(shù) × 100。實驗進行3次。

1.3 CO2加富對魁蚶稚貝3種酶活性的影響

取6個3 L三角瓶，分別加入2 L滅菌膜濾海水。每個培養(yǎng)容器頂面設(shè)置兩管：其中一個管設(shè)置為進氣管，通入過濾自然空氣(對照組，3個平行)和1 000 μatm CO2的過濾混合空氣(CO2組，3個平行)，通氣流量控制在0.1 L·min-1。CO2濃度和通氣流量由CO2加富器控制；另一個管設(shè)置為出氣口，并于出氣口處設(shè)置針頭過濾器(MCE Syringe Filter，北京譜朋科技有限公司)以防止外界顆粒和微生物進入培養(yǎng)系統(tǒng)。

每個培養(yǎng)容器中放置40只生長狀態(tài)良好、絨毛完整的魁蚶稚貝，使其自然散落在培養(yǎng)容器底部。培養(yǎng)周期為14 d，溫度控制在20°C，每天喂食一次，喂食前換水(對照組培養(yǎng)容器加入提前泵入過濾空氣至pH值穩(wěn)定的滅菌海水，CO2組培養(yǎng)容器加入提前泵入含1 000 μatm CO2的混合空氣至pH值穩(wěn)定的滅菌海水)并清理糞便等雜質(zhì)。

每隔1天正午12：00取各培養(yǎng)容器內(nèi)水體(10 mL)，測量pH值(pH計，PB-10，Sartorius，德國)和溶解無機碳(Dissolved inorganic carbon, DIC)濃度(總有機碳分析儀，TOC-VCPN，島津SHIMADZU，日本)；每個容器內(nèi)取3只生長狀態(tài)良好的魁蚶稚貝，用游標卡尺測其體長，去殼后測其組織的SOD、CAT和AChE活性(U/mgprot)。3種酶活性均采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)環(huán)境的變化

實驗過程中，CO2組pH值明顯降低，第2～14天CO2組pH值極顯著低于對照組(P<0.01)(見圖1(a))。CO2組培養(yǎng)水體平均pH降至7.71，比對照組培養(yǎng)過程中平均pH(8.30)低0.59。CO2濃度升高還引起了培養(yǎng)水體DIC濃度的上升。除第2天外，CO2組DIC濃度(平均值為34.50 mg/L)極顯著高于對照組(29.96 mg/L)(P<0.01)(見圖1(b))。

2.2 CO2加富對魁蚶稚貝潛沙過程的影響

CO2組魁蚶稚貝初次潛沙時間((5.7±0.5)min)相比對照組((7.8±1.3)min)顯著縮短(P< 0.01)，同時CO2組魁蚶稚貝1 h潛沙率((69.67 ± 5.13)%)相比對照組((61.33 ± 3.21)%)顯著升高(P< 0.01)(見圖2)。

2.3 CO2加富對魁蚶稚貝3種酶活性的影響

實驗開始時魁蚶稚貝殼長為(17.20 ± 0.03) mm。在培養(yǎng)過程中，CO2組魁蚶稚貝殼未出現(xiàn)明顯生長；對照組魁蚶稚貝殼長在培養(yǎng)第4天起持續(xù)增長，并從第8天開始顯著高于CO2組(P<0.05)。實驗結(jié)束時，CO2組魁蚶稚貝體長((17.24 ± 0.02)mm)顯著低于對照組((17.37 ± 0.07) mm)(P<0.05)(見圖3 (a))。

(* P<0.05；** P<0.01, Error bar: SD)

(** P<0.01, Error bar: SD)圖2 CO2組和對照組魁蚶稚貝初潛時間和潛沙率Fig.2 The first burrowing time and burrowing rate of Scapharca broughtonii in CO2 and control treatments

對照組魁蚶稚貝SOD活性在培養(yǎng)過程中沒有明顯變化；CO2組魁蚶稚貝SOD活性在培養(yǎng)前4天內(nèi)出現(xiàn)上升，并于第4天時((24.30±1.08) U/mgprot)顯著高于對照組((19.40±2.45) U/mgprot)(P<0.05)，之后出現(xiàn)下降。第6天始2個組SOD活性無顯著差異(見圖3 (b))。

2個組魁蚶稚貝CAT活性在前4天均出現(xiàn)上升但無顯著差異。之后，CO2組魁蚶稚貝CAT活性基本不變，對照組魁蚶稚貝CAT活性在第6天始出現(xiàn)下降并低于CO2組，在第12天出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，其余時間均無顯著差異(見圖3(c))。

培養(yǎng)實驗開始后對照組魁蚶稚貝AchE活性開始下降，而CO2組魁蚶稚貝AchE活性在培養(yǎng)過程中沒有明顯變化，兩實驗組魁蚶稚貝AchE活性除在第10天出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)外，在培養(yǎng)過程中無顯著差異(見圖3(d))。

3 討論

魁蚶無水管，其幼體營附著生活，成長過程中足絲退化，轉(zhuǎn)為埋棲生活并具有潛沙的特性，潛居后以殼的后緣在沙面形成通水孔[19]。海洋貝類對潛沙行為的調(diào)控是其適應(yīng)環(huán)境變化的表現(xiàn)，它們可以通過降低潛沙速率以降低耗能儲存能量[20]，也可以通過增高潛沙速率躲避不利環(huán)境條件如捕食者的攝食等[21]。有研究表明，魁蚶稚貝可以通過對其潛沙行為的調(diào)節(jié)適應(yīng)生活環(huán)境的變化[15]，本研究結(jié)果顯示，高CO2濃度條件下魁蚶稚貝初潛時間顯著減小，潛沙率顯著增加，潛沙行為受到促進，說明魁蚶稚貝趨于躲避CO2濃度升高造成的不利環(huán)境。

CO2濃度升高條件下，培養(yǎng)水體pH和DIC濃度等發(fā)生顯著變化，魁蚶稚貝殼生長過程受到抑制(見圖3(a))。在高CO2濃度條件下，鈣化生物會降低其鈣化率，殼甚至會溶解[22]。雙殼類幼體的殼由較不穩(wěn)定的霰石(aragonite)組成[23]，成體殼的成分轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮榉€(wěn)定的方解石(calcite)[24]。因此，雙殼類幼體相比成體更容易在高CO2濃度條件下受到不利影響。有研究表明，海灣扇貝(Argopectenirradias)的幼體相比成體更易受到高CO2濃度條件的影響[17]，地中海貽貝(Mytilusgalloprovincialis)胚殼開始形成的擔輪幼蟲階段在酸化條件下會出現(xiàn)發(fā)育延遲現(xiàn)象，但擔輪幼蟲階段以后不受海水酸化的影響[18]；然而，菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)稚貝和成體的生長在高CO2濃度條件下均無明顯變化[25]。本研究結(jié)果顯示，高CO2濃度條件下魁蚶稚貝殼的生長較為緩慢，1 000 μatm CO2濃度已經(jīng)對魁蚶稚貝殼的正常生長有不利影響。這表明酸化條件下，魁蚶等雙殼類生物的幼體和稚貝階段均可能受到不利影響。

高CO2濃度還對魁蚶稚貝的生理活動造成影響，研究表明,在潮汐出現(xiàn)時海水CO2濃度增加，海洋無脊椎動物體內(nèi)瓣膜關(guān)閉、呼吸作用增強[33-34]，同時體內(nèi)血淋巴(Hemolymph)pH值降低[26]，從而導致其抗氧化酶活性的升高；潮汐的周期性還使得潮間帶海洋無脊椎動物體內(nèi)抗氧化酶活性存在周期性變化[32]。CO2組和對照組魁蚶稚貝的3種酶(SOD，CAT和AChE)活性雖在實驗過程中無明顯差異，但CO2組3種酶活性的平均值均略高于對照組， 1 000 μatm CO2濃度條件下魁蚶稚貝可能已開始通過改變自身酶活性來適應(yīng)不利的環(huán)境變化。本文推測如果CO2濃度繼續(xù)升高(>1 000 μatm)，魁蚶稚貝3種酶活性將在一定范圍內(nèi)繼續(xù)升高。雙殼類對CO2濃度變化調(diào)節(jié)能力有限，CO2濃度升高將導致線粒體活性加強，線粒體中電子傳遞鏈(Electron Transport Chain，ETC)正常運轉(zhuǎn)受到影響[27-28]，而線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所[29]，ROS的產(chǎn)量的增加使得貝類抗氧化基因表達量出現(xiàn)上調(diào)[5]；而SOD和CAT活性增強可以使細胞中的ROS及時清除，使生物細胞免受環(huán)境變化導致的ROS產(chǎn)量升高的不利影響，保護生物細胞[30-31]。因而在本研究中升高的pCO2使魁蚶稚貝體內(nèi)氧化脅迫增強，為了使自身細胞免受大量ROS的不利影響，魁蚶稚貝SOD和CAT活性出現(xiàn)一定程度的升高。

((a)體長；(b)超氧化物歧化酶；(c)過氧化氫酶；(d)乙酰膽堿酯酶。(a)Body length; (b)SOD; (c)CAT; (d)AchE.)(*P<0.05, **P<0.01, Error bar: SD.)

圖3 CO2組和對照組魁蚶稚貝體長和3種酶活性變化曲線
Fig.3 The shell length and SOD, CAT, AChE activity ofScapharcabroughtoniiin CO2and control treatments

AChE的主要作用是通過催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Acetylcholine, ACh)來維持神經(jīng)沖動的正常傳遞[12]，AChE活性的升高意味著神經(jīng)沖動傳遞的增加。本研究中魁蚶稚貝在面對CO2濃度升高條件下，潛沙過程受到促進，本文推測魁蚶稚貝通過增加ACh來增加了神經(jīng)沖動的傳遞，其潛沙行為活動受到促進，而ACh的增加導致了AChE活性的升高。

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