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    高效液相色譜電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器的研制及在藥物分析中的應(yīng)用

    2018-03-14 00:57:34張凱鵬楊秀娟陳纘光
    分析化學(xué) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:鴉膽子電導(dǎo)亞油酸

    張凱鵬 楊秀娟 張 琳 陳纘光*

    1(中山大學(xué)藥學(xué)院, 廣州 510006) 2(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510282) 3(廣東省生物工程研究所,廣州 510316)

    1 引 言

    檢測器是色譜儀器最重要的組成部分之一。非接觸電導(dǎo)檢測器最初應(yīng)用于毛細管電泳[1,2],后來在微流控芯片分析中發(fā)展迅速[3]。它對荷電和極性物質(zhì)有很好的響應(yīng),且成本低、穩(wěn)定性好、易于與其它檢測器聯(lián)用,因此備受關(guān)注。

    2006年,電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測開始用于高效液相色譜,Kuban等[4]建立了氨基酸、非甾體抗炎藥和β受體阻斷劑等幾類物質(zhì)的測定方法。此后的研究報道包括肽[5]、大環(huán)聚羧酸酯衍生物[6]、脂肪酸[7]的分析等。Mark 等[8]比較了兩種用于高效液相色譜電容耦合非接觸電導(dǎo)的檢測池。然而,這些研究都采用商業(yè)化檢測器,通常需要制作檢測池,通過特殊的接頭才能實現(xiàn)與液相色譜的連接[9],使用不便,且不利于后續(xù)維護。而聚醚醚酮(Polyetheretherketone,PEEK)管直接穿過的電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測單元便于與液相色譜連接,且易于更換,成本較低,應(yīng)用前景廣闊。Gillespie 等[10]曾使用PEEK管直接穿過非接觸電導(dǎo)檢測池,但未對影響儀器性能的參數(shù)(電極間距、電極長度、PEEK管內(nèi)徑等)[11,12]做詳細探討。目前,關(guān)于高效液相色譜電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器的研究報道較少。

    鴉膽子油是一種中藥抗癌輔助藥,為細胞周期非特異性抗癌藥[13~15],其主要抗癌活性成分是油酸和亞油酸。油酸和亞油酸均具有長碳鏈結(jié)構(gòu),末端含羧基,在鴉膽子油中主要以脂肪酸甘油酯的形式存在,為弱紫外吸收物質(zhì)。傳統(tǒng)方法如高效液相色譜柱前衍生化法[16]、蒸發(fā)光散射法[17]等均有其各自缺點,如操作過程繁瑣、影響因素多,不利于油酸和亞油酸的準確定量分析。

    本研究采用自制的高效液相色譜電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器,實現(xiàn)了對鴉膽子油有效成分的分離檢測,為此類中藥制劑有效成分的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    Waters plus 717高效液相色譜儀(美國Waters公司); C18BP色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm,大連依利特公司); C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm,天津三維公司); FA1004分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司); ZB-2020色譜工作站(四川知本分析科技有限公司); SB-5200 DTDN超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。聚醚醚酮連接管(外徑均為1.57 mm,內(nèi)徑: 0.13、0.25、0.50、0.75和1.00 mm,常州優(yōu)沃世塑料制品有限公司)。所有電子元器件均購自廣州天河賽格數(shù)碼電子城。

    十二烷基磺酸鈉(SDS)、 油酸以及亞油酸分析標準品(純度>99.9%, 上海晶純生化科技股份有限公司); 甲醇、乙腈(色譜純, 美國BCR試劑有限公司); 鴉膽子油軟膠囊(華潤三九(南昌)藥業(yè)有限公司); 醋酸鈉(NaAc,分析純,天津市百世化工有限公司); NaOH(分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。 實驗用水為超純水, 由Millipore純水儀(美國Millipore公司)制備。流動相使用前超聲30 min,所有樣品均需經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后進樣。

    2.2 溶液制備

    2.2.1對照品儲備液的配制準確稱取十二烷基磺酸鈉對照品10 mg,以10%乙腈溶液溶解并定容至10 mL。準確稱取油酸、亞油酸對照品各10 mg,加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液,用90%甲醇溶解并定容至10 mL。所有對照品溶液均在4℃條件下保存,用時根據(jù)需要稀釋至所需濃度。

    2.2.2鴉膽子油溶液的皂化精確稱取鴉膽子油20 mg, 置于5 mL玻璃小瓶中, 加入0.5 mol/L NaOH甲醇溶液1 mL, 蓋上蓋子, 置于鼓風干燥箱中60℃反應(yīng)30 min后取出, 用90%甲醇溶解并定容至10 mL, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 液相色譜分離條件

    C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm),流動相: 甲醇-乙腈-1 mmol/L醋酸鈉溶液(50∶30∶20,V/V); 柱溫: 25℃; 流速: 1.0 mL/min; 進樣量: 20 μL。

    2.4 電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器的制作

    圖1 高效液相色譜-電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測裝置示意圖(A)檢測控制單元; (B) 電極盒內(nèi)部構(gòu)造; (C) 非接觸電極; a. 信號放大調(diào)節(jié)器; b.激發(fā)頻率調(diào)節(jié)器; c. 激發(fā)電壓調(diào)節(jié)器; d. 基線調(diào)節(jié)器; e. 電源開關(guān); f.色譜柱; g. PEEK 連接頭; h.信號屏蔽線; j,p. PEEK連接管; k. 屏蔽電路; l. 激發(fā)電極; m. 接收電極;n.信號插頭Fig.1 Schematic illustration of HPLC-C4D system(A) detector control unit; (B) inside view of contactless electrodes; (C) contactless electrodes box; a. amplifier adjuster; b. excitation frequency adjuster; c. excitation voltage adjuster; d. baseline adjuster; e. power switch; f. chromatographic column; g. PEEK junction fitting; h .shielding wire; j,p. changeable PEEK tubing; k. ground circuit; l. excitation electrode; m. pick-up electrode; n. sockets.

    如圖1所示,所研制的電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器由信號發(fā)生器、電極套管、接收放大器等組成。信號發(fā)生器和接收放大器等與本研究組曾研制的電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器相似[18]。信號發(fā)生器可提供頻率范圍10~150 kHz、電壓振幅0~100 V(有效值)的正弦高頻信號。兩個檢測電極(非接觸電極)由內(nèi)徑2.0 mm(液相色譜連接管剛好能穿過)的兩個銅管構(gòu)成,同軸固定于電路板上,檢測電極單元最后裝入5.3 cm×3.2 cm×1.5 cm的金屬盒中。金屬盒接地。將液相色譜PEEK連接管(外徑1.57 mm)穿過檢測電極,一端用PEEK連接頭與色譜柱出口連接,另一端與紫外檢測器相連接或放空。此連接方式并不破壞液相色譜的整個系統(tǒng),使用方便。信號接收放大器將信號放大整流,經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換后由色譜工作站和計算機實現(xiàn)數(shù)據(jù)的記錄與處理。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 儀器參數(shù)優(yōu)化

    3.1.1激發(fā)電壓的影響激發(fā)電壓是影響電容耦合非接觸電導(dǎo)儀器性能的重要因素之一。將激發(fā)頻率設(shè)定在60 kHz,其它參數(shù)均固定,研究激發(fā)電壓在15~90 V時對檢測的影響。圖2A是十二烷基磺酸鈉的色譜圖,根據(jù)其峰高和信噪比值可確定最優(yōu)的激發(fā)電壓。從圖2B可見,隨著激發(fā)電壓增大,峰高也增大。當激發(fā)電壓低于60 V時,信噪比隨電壓的增大而增大。然而,當電壓高于60 V時,基線的噪音也增大,導(dǎo)致信噪比下降。 因此,選擇60 V為最優(yōu)的激發(fā)電壓。

    3.1.2激發(fā)頻率的影響在激發(fā)電壓為60 V的條件下,在15~120 kHz 范圍內(nèi)考察十二烷基磺酸鈉(500 μg/mL)在液相色譜系統(tǒng)分離條件下的響應(yīng)及信噪比情況(圖2C)。激發(fā)頻率低于70 kHz時,信噪比隨著頻率的增大而增大; 當激發(fā)頻率大于70 kHz時,雖然峰高增大明顯,但是噪音增大更為明顯,導(dǎo)致信噪比大大降低。因此選擇70 kHz為儀器的最優(yōu)激發(fā)頻率。

    圖2 (A)十二烷基磺酸鈉的色譜圖: 1. 溶劑峰; 2. 十二烷基磺酸鈉(500 μg/mL); (B) 激發(fā)電壓對峰高和信噪比的影響(固定頻率60 kHz); (C)激發(fā)頻率對峰高和信噪比的影響(固定電壓 60 V)Fig.2 (A) Response of SDS with C4D: 1.solvent peak; 2. SDS (500 μg/mL); (B) Influence of the excitation voltage on peak height and S/N at a constant frequency of 60 kHz; (C) Influence of excitation frequency on peak height and S/N at a constant voltage of 60 V

    3.1.3電極間距的影響電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測器的兩個電極之間的間距對儀器性能也有影響。固定激發(fā)電壓60 V,激發(fā)頻率70 kHz,考察了電極間距在0.5~3.5 mm范圍內(nèi),對500 μg/mL十二烷基磺酸鈉在液相色譜系統(tǒng)分離條件下的響應(yīng)及信噪比情況(圖3A)。當電極間距小于1.5 mm時,峰高隨距離的增大并不明顯,但是信噪比同時也在增大,電極太靠近時,噪音相對較大,信噪比在電極間距較小時較低,這說明合適的范圍內(nèi),影響信號的因素主要是噪音; 然而,當間距大于1.5 mm時,峰高和信噪比都出現(xiàn)了較大程度的下降,說明電極間距較大時,峰高成為影響靈敏度的主要因素。后續(xù)實驗將電極間距固定在1.5 mm。

    3.1.4電極長度的影響設(shè)定激發(fā)電壓60 V、激發(fā)頻率70 kHz、電極間距1.5 mm,考察電極長度在4~18 mm時,十二烷基磺酸鈉(500 μg/mL)經(jīng)液相色譜分離后的響應(yīng)及信噪比情況。從圖3B可見,隨著電極長度增加,峰高也增高,但是當電極長度大于10 mm時,隨著電極長度增大,信噪比并未明顯增大,反而略有降低; 另一方面,電極長度過長,對分離度也會產(chǎn)生影響。因此,選擇10 mm作為最優(yōu)的電極長度。

    圖3 (A) 電極間距對峰高和信噪比的影響; (B) 電極長度對峰高和信噪比的影響Fig.3 (A) Effect of distance between excitation electrode and receiving electrode on peak height and signal to noise ratio (S/N); (B) Effect of length of excitation electrode and receiving electrode on peak height and S/N

    圖4 不同內(nèi)徑的PEEK管對電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測靈敏度的影響流動相- 乙腈-水(35∶65, V/V); 流速,1 mL/min。 峰1. 十二烷基磺酸鈉(20 μg/mL); 管徑:a. 0.13 mm; b. 0.25 mm; c. 0.50 mm; d. 0.75 mm; e. 1.00 mm.Fig.4 Effect of the different internal diameters tubing on C4D sensitivity using SDS at a concentration of 20 μg/mL: a. 0.13 mm; b. 0.25 mm; c. 0.50 mm; d.0.75 mm; e.1.00 mm. Mobile phase composition: acetonitrile-water (35∶65, V/V); flow rate, 1 mL/min. Peak definition: 1. SDS.

    3.1.5不同內(nèi)徑的PEEK管的影響高效液相色譜儀連接管的材料多用聚醚醚酮,適合用于非接觸電導(dǎo)檢測。在行業(yè)內(nèi),連接管的外徑相同,為1/16英寸(即1.57 mm),內(nèi)徑則有不同規(guī)格。不同的內(nèi)徑對應(yīng)于不同的管壁厚度,對應(yīng)于不同的耦合電容量和不同的回路總阻抗,最終影響檢測信號強弱。連接管的內(nèi)徑越大,管壁越薄,耦合電容量越大,回路的總阻抗越小,得到的檢測信號越強[19]。連接管內(nèi)徑還涉及擴散效應(yīng)的影響。連接管的內(nèi)徑大于色譜柱出口的內(nèi)徑時,流動相從小內(nèi)徑的管路流進大內(nèi)徑的管路,常會引起成分區(qū)帶的擴散,導(dǎo)致峰變寬,靈敏度變差,還使得分離度下降[20]。

    圖5 鴉膽子油樣品和油酸、亞油酸標準品混合物的電容耦合非接觸電導(dǎo)色譜圖(a) 200 μg/mL標準品混合物, (b) 400 μg/mL皂化后的鴉膽子油樣品. 色譜峰: 1. 溶劑峰; 2.亞油酸; 3.油酸。Fig.5 HPLC-C4D detection of (a) standard mixture sample at a concentration of 200 μg/mL, (b) Brucea javanica oil (400 μg/mL) sample with saponification process. Peak assignment: 1. solvent peak: 2.linoleic acid, 3.oleic acid.

    考察了5種不同內(nèi)徑的PEEK連接管對靈敏度的影響。如圖4所示,當PEEK連接管內(nèi)徑為0.13 mm時,幾乎觀察不到十二烷基磺酸鈉的峰,可能是小內(nèi)徑管壁太厚,回路總阻抗太大,導(dǎo)致靈敏度太低,幾乎觀察不到信號。當使用內(nèi)徑為0.75和1.00 mm時,擴散效應(yīng)明顯。0.50 mm內(nèi)徑的PEEK連接管具有最高的峰高和信噪比,可能是管壁厚度和回路總阻抗適中,而擴散效應(yīng)影響較小。綜上所述,0.50 mm內(nèi)徑的PEEK管具有最高的靈敏度。

    3.2 方法學(xué)驗證

    3.2.1精密度取100 μg/mL的油酸和亞油酸的混合標準品連續(xù)進樣6次,色譜峰見圖5a,記錄峰面積,并計算相對標準偏差值。結(jié)果表明,油酸和亞油酸峰面積的RSD分別為1.5%和1.1%,表明儀器的精密度良好。

    3.2.2方法重復(fù)性稱取相同質(zhì)量的6份鴉膽子油溶液,用同樣的方法皂化處理,最終稀釋至200 μg/mL,分別進樣,色譜峰見圖5b。結(jié)果表明,油酸和亞油酸峰面積的RSD值分別為1.9%和1.8%, 表明本方法具有很好的重復(fù)性。

    3.2.3線性范圍和檢出限準確移取適量標準品儲備液,配成系列濃度的標準溶液,在最優(yōu)實驗條件下進樣,記錄每個濃度所對應(yīng)的峰面積,將濃度對峰面積作標準曲線。檢出限通過配制系列低濃度樣品,計算信噪比(S/N=3)得到。如表1所示,油酸及亞油酸在5~1000 μg/mL線性關(guān)系良好,r>0.99,檢出限分別為2.5和1.0 μg/mL。

    3.2.4回收率將對照品溶液按高、中、低3種濃度(每個濃度配3個樣)分別加入到已知濃度的樣品溶液中,測定加標回收率。如表2所示,油酸和亞油酸的平均回收率分別在99.0%~100.8%和98.0%~101.3%范圍內(nèi),表明本方法測定結(jié)果準確可靠。

    3.2.5樣品穩(wěn)定性將皂化后的樣品放置于室溫條件下,分別在0、4、8、12、24和48 h進樣。結(jié)果表明,油酸和亞油酸峰面積的RSD值分別為1.8%和2.4%。因此, 樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    表1 亞油酸與油酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限 (濃度點, 9;y, 峰面積;x, 樣品濃度)

    Table 1 Regression equation, correlation coefficient, linearity range and limit of detection (LOD) of linoleic acid and oleic acid (n=9;y, peak area;x, concentration)

    組分Components回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)Coefficientofcorrelation(r)線性范圍Linearrange(μg/mL)檢出限LOD(μg/mL)亞油酸Linoleicacidy=5174.1x-2.40×1040.99925~10001.0油酸Oleicacidy=9163.4x-0.70×1040.99845~10002.5

    3.3 樣品分析

    選取3個批次的鴉膽子油軟膠囊進行測定,結(jié)果列于表3。鴉膽子油中油酸含量在51.6%~55.8%之間,亞油酸含量在30.3%~32.8%之間,是鴉膽子油的兩個主要成分。與其它方法比較,油酸含量較為接近,本方法測得亞油酸含量為30%,而高效液相色譜(HPLC)紫外直接測定法[21]測得亞油酸含量為12.5%,HPLC-紫外柱前衍生化法[22]測得亞油酸含量為23.4%, 這可能是由于不同廠家、不同產(chǎn)地的原材料提取的鴉膽子油的有效成分存在差異,這也體現(xiàn)了中藥質(zhì)量控制的復(fù)雜性。目前,藥典中并未有鴉膽子油軟膠囊中油酸、亞油酸的具體質(zhì)量標準,而油酸和亞油酸作為鴉膽子油的兩個主要成分,其含量的測定對藥物質(zhì)量的控制具有重要意義,本研究為鴉膽子油的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

    表2 亞油酸與油酸的加標回收率實驗結(jié)果

    Table 2 Recoveries of standard additions of linoleic acid and oleic acid

    組分Components測定值Found(μg/mL)加入量Added(μg/mL)測得量Totalfound(μg/mL,n=3)回收率Recovery(%,n=3)相對標準偏差RSD(%,n=9)亞油酸Linoleicacid131.5油酸Oleicacid243.8100.0231.298.0125.0258.1101.3150.0278.698.4200.0446.1100.8250.0494.899.1300.0537.699.02.81.7

    表3 3批鴉膽子油軟膠囊的測定結(jié)果與其它的方法的比較

    Table 3 Comparison of detection results of contents of linoleic acid and oleic acid in samples ofBruceajavanicaoil (n=3) by this method and literature methods

    批號Batchnumber本方法Thismethod?(n=3)1503002J1506007J1506008J其它方法OthermethodsHPLC?紫外直接測定法[21]HPLC?UVHPLC?紫外柱前衍生化法[22]HPLC?derivatization亞油酸Linoleicacid(%)31.6±0.732.8±0.930.3±1.112.523.4油酸Oleicacid(%)55.8±1.255.8±0.151.6±0.961.365.6

    上述結(jié)果表明, 此檢測器具有優(yōu)良的性能,適合于用于荷電或極性成分的定性和定量分析。但此檢測器的靈敏度相對較低,可能由兩方面的原因: (1)儀器方面,因為目前所能得到的液相色譜連接管的管壁均較厚,導(dǎo)致回路總阻抗較大。雖然提高激發(fā)頻率可以降低回路阻抗,但噪音增加,信噪比改善不明顯; (2)電導(dǎo)檢測是基于被測成分與背景溶液的電導(dǎo)值的差異,而液相色譜測定荷電或極性成分時所用流動相的背景電導(dǎo)值是相當大的,這是靈敏度不高的主要原因之一。

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