基于雙回路技術的二維色譜在線/離線接口設計與評價

唐 濤 張維冰 張 政 夏明珠 貢雪東 王風云 李 彤

1(南京理工大學工業(yè)化學研究所，南京 210094) 2(齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，齊齊哈爾 161006) 3(大連依利特分析儀器有限公司，大連 116023)

1 引 言

二維液相色譜技術以其高峰容量、高分辨力的特點，成為近年來蛋白質(zhì)分析[1,2]、中藥成分分析[3,4]、代謝組學研究[5]的重要方法之一。二維接口是二維液相色譜系統(tǒng)的核心，常見的接口形式可分為離線接口和在線接口兩大類。離線接口[6,7]依次收集第一維的餾分，隨后通過轉移進行第二維分析。在線接口的形式多種多樣，是二維接口發(fā)展的主要趨勢。定量環(huán)接口[8,9]利用定量環(huán)存儲第一維的樣品，通過閥切換將樣品切入第二維分析。對于停流接口[10]，第一維洗脫產(chǎn)物直接轉移到第二維色譜柱柱頭，轉動切換閥，第二維開始分析，此時第一維停流。對于平行柱接口[11]，利用兩支同樣的色譜柱交替富集第一維的樣品，并作為第二維的分析柱使用; 對于捕集柱接口[12]，第一維的洗脫產(chǎn)物富集到捕集柱柱頭，切換閥后，第二維流動相將捕集柱上的樣品反沖到第二維色譜柱上進行分析。此外，還有一些特殊的接口形式，如真空輔助溶劑蒸發(fā)接口[13]、液滴微流控接口[14]等。已報道的這些接口中，離線接口結構簡單，對設備要求不高，并可以對第一維餾分進行相應的濃縮、合并、脫鹽等操作，但轉移過程中易造成樣品損失、污染; 定量環(huán)接口結構簡單，但第二維樣品有效樣品量偏低，影響檢測靈敏度; 停流接口，第二維不受分析時間限制，可以充分發(fā)揮系統(tǒng)分辨率，但第一維停流往往容易使樣品擴散; 平行柱接口避免了停流接口的擴散問題，但第二維分析時間受到第一維分離時間的限制; 捕集柱接口有在線富集的功能，可很好的保證第二維樣品濃度，但捕集效率不穩(wěn)定是不可忽略的問題，且第二維分析時間同樣受到第一維限制。總體上，這些接口有各自的優(yōu)點，但也都受到一定的限制，應用范圍有限，不能滿足多種分離目的靈活切換的需求; 且自動化、集成化程度不高，不適合分析時間長、數(shù)量大的樣品。

在本研究組前期工作的基礎上[15,16]， 本研究設計了一種兼有樣品收集、進樣功能的新型在線/離線接口，可完成樣品微量制備、難分離組分的精細拆分和復雜樣品的二維分離。分別以芳香族化合物、蛋白質(zhì)樣品、蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物為分析對象，對接口進行系統(tǒng)的評價，獲得了良好的結果。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

iChrom 5100高效液相色譜儀，包括P5102高壓恒流泵、D5101紫外-可見檢測器、M5102系統(tǒng)組織器、W5100色譜數(shù)據(jù)工作站等(大連依利特分析儀器有限公司); FE20 pH計(瑞士Mettler Toledo公司); C52-1346I兩位六通切換閥(瑞士Valco公司); Biobasic SCX色譜柱(250 mm ×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?, 美國Thermofisher 公司); Supersil ODS2色譜柱(250 mm ×4.6 mm i.d., 5 μm, 120 ?, 大連依利特分析儀器有限公司)，SinoChrom C8色譜柱(150 mm×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?, 大連依利特分析儀器有限公司)。

苯乙酮、甲苯、乙苯、芴、尿素、碳酸氫銨(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司); 甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia試劑公司); 細胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)、核糖核酸酶A(RNase A)、核糖核酸酶B(RNase B)、雞卵清白蛋白(Chicken egg white albumin, CEA)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)均購自Sigma-Aldrich公司; 三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)、二硫蘇糖醇(98%, Dithiothreitol, DTT)購自北京百靈威科技有限公司; 碘乙酰胺(99%, Iodoracetamide, IAA, Amresco公司); 實驗用水為超純水(Milli-Q，美國Millipore公司)。

2.2 實驗方法

2.2.14種芳香族化合物的微量制備樣品：苯乙酮、甲苯、乙苯、芴(2×10-7g/mL)。進樣量為20 μL。收集條件： 1#餾分2.5～3.5 min，2#餾分5.0～6.0 min，3#餾分7.0～8.0 min，4#餾分13.0～14.0 min。再進樣條件：收集到4組餾分各1 mL，濃縮至約0.3 mL，再依次進樣，進樣量為100 μL。色譜條件： Supersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm); 流動相為甲醇-水(85∶15,V/V); 流速1.0 mL/min; 檢測波長254 nm。

2.2.25種蛋白質(zhì)的精細拆分(1)樣品制備 分別稱取BSA 2.3 mg、Cyt C 2.0 mg、RNase A 2.0 mg、RNase B 4.1 mg和CEA 2.3 mg，用1 mL乙腈-水(2∶98,V/V, 含0.1% TFA)溶解， 0.22 μm濾膜過濾，備用。(2)第一維強陽離子交換色譜(Strong cation exchange chromatography, SCX) Biobasic SCX色譜柱(250 mm ×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?); 流動相A為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.37); 流動相B為流動相A+1.0 mol/L NaCl(pH 5.37); 梯度洗脫條件: 0～30 min，10%～30% B； 30～40 min, 50% B， 流速1.0 mL/min; 進樣量20 μL; 檢測波長214 nm。(3)第二維反相色譜(Reversed-phase chromatography, RP) SinoChrom C8色譜柱(150 mm×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?); 流動相A為乙腈-水(2∶98,V/V)+0.1% TFA; 流動相B為乙腈-水(98∶2,V/V)+0.1% TFA; 梯度洗脫條件: 0～3 min, 5% B; 3～5 min, 5%～25% B; 5～17 min, 25%～75% B; 17～20 min, 75%～5% B。 流量1.0 mL/min; 進樣量20 μL; 檢測波長214 nm。

2.2.3BSA酶解產(chǎn)物的二維分離(1)樣品制備 稱取1.0 mg BSA溶于8 mol/L 尿素和100 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH 8.0)中; 加入8 μL 1 mol/L DTT，60 ℃水浴反應2 h; 加入20 μL 1 mol/L IAA，常溫下避光反應0.5 h; 隨后使用100 mmol/L NH4HCO3將樣品中尿素濃度稀釋至1 mol/L，并按質(zhì)量比1∶25加入胰蛋白酶，37 ℃下反應過夜; 最后，將得到的蛋白質(zhì)酶解液調(diào)至酸性，除鹽后凍干，待用。(2)第一維強陽離子交換色譜 Biobasic SCX色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?); 流動相A為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 2.2); 流動相B為流動相A+0.5 mol/L NaCl(pH 2.2); 梯度洗脫程序： 0～10 min， 0% B; 10～30 min，0～100% B; 30～60 min，100% B; 60～70 min，0% B。流速0.5 mL/min; 進樣量100 μL; 檢測波長214 nm。(3)第二維反相色譜 XBP C18色譜柱(150 mm × 0.3 mm i.d., 5 μm, 實驗室自制); 流動相A為乙腈-水(2∶98,V/V)+0.1% TFA; 流動相B為乙腈-水(98∶2,V/V)+0.1% TFA; 梯度洗脫條件: 0～10 min, 0% B; 10～70 min, 5%～35% B; 70～80 min, 100% B; 80～95 min, 0% B。流速8.0 μL/min; 進樣量5 μL; 檢測波長214 nm。

3 結果與討論

3.1 在線/離線接口的設計

雙回路技術采用一套機械傳動組件和流路系統(tǒng)，實現(xiàn)雙重功能。本研究基于一套三維機械傳動裝置控制樣品針以及一套樣品托盤、活塞、兩位三通閥和同一套流路系統(tǒng)，利用2個兩位六通切換閥，設計了一種全新的接口，如圖1所示。通過活塞、樣品針吸入樣品至閥A的定量環(huán)，控制閥A的位置狀態(tài)，實現(xiàn)LC-A系統(tǒng)的自動進樣; 也可通過閥B和閥A的連接和控制，經(jīng)過樣品針，實現(xiàn)對LC-B系統(tǒng)分離餾分的收集，形成兩個可控、互不干擾的回路。同時，設計了配套的色譜數(shù)據(jù)工作站，可集成化控制接口中各個閥的狀態(tài)和多套液相色譜儀，結合序列分析和外部觸發(fā)兩種方式，可靈活實現(xiàn)在線/離線功能。

圖1 在線/離線接口流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of online/offline interface

3.2 接口的功能實現(xiàn)

進樣和餾分收集功能：通過電路和軟件程序控制，控制閥A在實線狀態(tài)，閥B在實線狀態(tài)，移動樣品針到指定的樣品瓶，通過活塞將樣品吸入閥A的定量環(huán)中，完成上樣; 切換閥A到虛線狀態(tài)，可將樣品推入LC-A系統(tǒng)中進行色譜分析，實現(xiàn)進樣。此時，通過切換三通閥C，利用活塞吸入清洗溶劑，再切換閥C，推動活塞，可實現(xiàn)清洗樣品針; 同時也可以通過閥B連接的泵，推入溶劑，清洗樣品針外側，避免交叉污染。切換閥B到虛線狀態(tài)，LC-B系統(tǒng)分析的樣品，通過閥B，連接閥A，通過樣品針可以收集到指定的樣品瓶中，實現(xiàn)餾分收集功能。再次控制閥A到實線狀態(tài)、閥B到實線狀態(tài)，可重復上述功能。

3.2.1樣品的微量制備功能當LC-A和LC-B是同一系統(tǒng)，利用接口完成進樣后，繼續(xù)通過接口按時間直接收集全部餾分或者按出峰信號收集感興趣的餾分; 然后對所收集餾分在線進行二次分析，或離線濃縮處理后再分析，獲得餾分的純度信息，進一步完成后處理，實現(xiàn)樣品的微量制備。

3.2.2難分離組分的精細拆分功能通過接口連接兩套不同的色譜系統(tǒng)，通過LC-B系統(tǒng)對樣品進行第一級分離; 根據(jù)分離的結果，選擇性地將難分離組分收集; 進一步采用LC-A系統(tǒng)進行第二級分離，根據(jù)樣品濃度選擇直接在線進樣或者離線處理后再進樣。通過兩級分離，可以完成對樣品的精細拆分。

3.2.3復雜樣品的二維分離功能對于復雜樣品，通過接口構建二維色譜系統(tǒng)進行高效分離。離線模式，通過LC-B系統(tǒng)進行第一維分離，將樣品全部收集，并通過離線方式對餾分進行合并、濃縮、除鹽等處理后，通過接口依次進入到LC-A系統(tǒng)中進行第二維分析。在線模式，通過接口同時連接一套常規(guī)分析系統(tǒng)(LC-B)和一套微量色譜系統(tǒng)(LC-A)，以圖1為例，當閥A和閥B均處于虛線位置，利用LC-B完成第一維分析，餾分收集至托盤的樣品瓶中; 切換閥B到實線位置，利用三通閥C和活塞清洗管路和樣品針，避免交叉污染; 由于第二維是微量系統(tǒng)，樣品無需進一步濃縮，切換閥A到實線位置，選擇需要的餾分，直接上樣到定量環(huán)中; 再次切換閥A到虛線位置，餾分進入LC-A系統(tǒng)完成第二維分析; 此過程全程通過軟件實現(xiàn)自動化控制，無人為干擾。

3.3 接口的評價

3.3.1樣品的微量制備近年來，越來越多的稀有樣品通過分析型液相色譜完成微量制備，如生物樣品活性組分的提取[17]、中藥組分對照品的制備[18]。本研究中，利用一套液相色譜系統(tǒng)，連接新設計的接口，按照2.2.1節(jié)所述實驗條件，對4種芳香族化合物進行了分離。圖2A是4種化合物的分離譜圖，各組分得到了基線分離。按照圖上標注虛線位置為起始點收集4組餾分，并離線進行濃縮后，再依次進樣到同一套色譜系統(tǒng)分析，疊加譜圖如圖2B所示，各餾分純度高且保留時間與目標物一致。此實驗說明，利用接口的進樣-收集-再進樣，按照預設域值在線收集對應餾分，通過再次進樣分析可以獲得餾分的純度信息，完成樣品的微量制備。

圖2 (A)分離4種芳香族化合物色譜圖; (B)4組餾分再進樣疊加譜圖。 1. 苯乙酮; 2. 甲苯; 3. 乙苯; 4. 芴Fig.2 (A) Chromatogram of 4 kinds of aromatic compounds; (B) Stacked chromatogram of 4 fractions. 1. Acetophenone; 2. Toluene; 3. Ethylbenzene; 4. Fluorene

3.3.2難分離組分的精細拆分利用新構建的接口連接兩套液相色譜系統(tǒng)，按照2.2.2節(jié)所述步驟分離5種蛋白質(zhì)樣品，結果如圖3所示。BSA和CEA屬于酸性蛋白質(zhì)，由于采用了pH 5.37的流動相進行洗脫，所以在SCX模式下，BSA和CEA幾乎沒有保留，在系統(tǒng)死時間出峰，其余3種蛋白質(zhì)樣品分離效果良好。直接按照保留時間，在控制軟件設定收集的時間窗口，將圖中峰“1+2”的餾分收集，切入第二維RP模式，BSA和CEA得到了基線分離。通過設計的接口，可以連接二維系統(tǒng)，并根據(jù)一維分離情況，選擇性的將部分餾分切入第二維，實現(xiàn)難分離組分的精細拆分。

圖3 5種蛋白質(zhì)樣品的分離譜圖1.牛血清白蛋白; 2. 雞卵清白蛋白; 3. 核糖核酸酶B; 4. 核糖核酸酶A; 5. 細胞色素CFig.3 Chromatogram of 5 kinds of proteins1. Bovine serum albumin (BSA); 2. Chicken egg white albumin (CEA); 3. RNase B; 4. RNase A; 5. Cytochrome C

3.3.3復雜樣品的二維分離BSA酶解產(chǎn)同時具有疏水、親水等成分。采用設計的接口連接兩套液相色譜系統(tǒng)，第一維采用SCX模式，充分發(fā)揮上樣量高的優(yōu)勢; 為了減少離線濃縮的二次處理步驟，第二維直接采用微柱RP模式，通過設定序列表全自動在線分離。如圖4A所示，采用SCX模式，樣品響應可分為兩個區(qū)域，區(qū)域Ⅰ(5～20 min)，組分響應少且不高，按照出峰分2個餾分進入第二維; 區(qū)域Ⅱ(24～36 min)有集中的、較強響應，后續(xù)按每0.5 min一個餾分連續(xù)收集并全部依次進入第二維分析。由于第一維SCX模式采用了高鹽的流動相，第二維RP模式前10 min設置了較低比例有機相(2% 乙腈)的洗脫，一方面起到在線除鹽的作用，另一方面可以更好兼容兩維的流動相。二維分析結果如圖4B所示，樣品得到了較好的分離效果，以1 mAU為積分閾值，共識別色譜峰292個。此外，整個二維分析用時約45 h，基于設計的接口，配合色譜數(shù)據(jù)工作站，全過程實現(xiàn)了自動化分析，消除了人為操作帶來的誤差。

圖4 (A)BSA酶解產(chǎn)物SCX分離譜圖; (B)BSA酶解產(chǎn)物二維分離譜圖Fig.4 (A) SCX chromatogram of a tryptic digest of BSA; (B) 2D-LC chromatogram of a tryptic digest of BSA

4 結 論

以雙回路技術為基礎，設計了一種二維色譜在線/離線接口。采用4種芳香族化合物、5種蛋白質(zhì)樣品和BSA酶解產(chǎn)物對設計的接口進行了系統(tǒng)地評價。結果表明，通過接口連接不同色譜系統(tǒng)，不僅可以實現(xiàn)基本的自動進樣和餾分收集功能，還可利用色譜數(shù)據(jù)工作站設定程序?qū)崿F(xiàn)樣品的微量制備、難分離組分的精細拆分和復雜樣品的二維分離。該接口功能強大、自動化程度高，為二維液相色譜的集成化控制及復雜樣品的分析提供了有力工具。

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