響應(yīng)面法優(yōu)化花生莖葉黃酮的提取工藝及其抗氧化活性研究

焦昆鵬 馬麗蘋 朱文學(xué) 易軍鵬 羅 磊 樊金玲 向進(jìn)樂 海 闖

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，洛陽 471023) (河南省食品原料工程技術(shù)研究中心2，洛陽 471023)

黃酮類化合物在自然界中存在極其廣泛，它們通常以苷類形式存在于植物內(nèi)，各種黃酮苷類化合物因糖類的種類、連接位置、數(shù)量以及連接方式的不同而各異[1]。近年來，黃酮類物質(zhì)一直備受關(guān)注，其因獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具有良好的抗氧化、抗癌、抗菌和抗炎等功能[2-5]。隨著人們對人工合成食品抗氧化劑的質(zhì)疑聲越來越高，天然抗氧化劑的研究成為食品領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一[6-7]。從自然界繁多的植物原料中選擇合適材料并提取天然抗氧化劑是未來食品抗氧化劑的發(fā)展趨勢[8-10]。

花生(ArachishypogaeaL)是我國重要的油料、經(jīng)濟(jì)作物之一，自古都被廣泛種植[11]。而作為花生附屬產(chǎn)物的花生莖葉除少部分入藥和作為牛羊飼料外，多數(shù)都被廢棄或直接燃燒，造成了資源的極大浪費(fèi)和對環(huán)境的破壞[12]。鄧保煒等[13]對花生植株不同部位的黃酮含量進(jìn)行了研究，證明花生葉片中黃酮含量最高，莖蔓次之，花生殼和花生根黃酮含量最少，整株平均含量可達(dá)2.58%。由此可見，花生莖葉中黃酮類化合物含量極為豐富，以花生莖葉為原料提取黃酮，可實(shí)現(xiàn)廢物再利用，提高資源的利用率，保護(hù)環(huán)境。

自古以來花生莖葉都被作為藥物利用，所以關(guān)于花生莖葉提取物的降壓、鎮(zhèn)靜催眠等藥用功效研究較多。劉勁松等[14]在對花生莖葉的鎮(zhèn)靜催眠作用進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)花生莖葉的石油醚提取部分和乙酸乙酯提取部分的鎮(zhèn)靜催眠作用最強(qiáng)，能顯著減少小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。韋國鋒等[15]對花生莖葉降壓作用研究時(shí)發(fā)現(xiàn)降壓功效成分主要是黃酮類物質(zhì)。而關(guān)于花生莖葉黃酮的抗氧化性能少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了花生莖葉黃酮的提取工藝，并在此基礎(chǔ)上研究了所提取總黃酮的抗氧化活性。經(jīng)優(yōu)化花生莖葉黃酮的提取率達(dá)到3.73%，且保持了良好的抗氧化活性。本研究為花生莖葉的綜合利用和提取花生莖葉黃酮作為天然食品抗氧化劑等提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生莖葉，采收自河南省南陽地區(qū)當(dāng)年花生成熟莖葉，自然晾曬；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:上海金穗生物科技有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)自由基：Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177型高速粉碎機(jī)：北京永光明；TDZ5-WS型離心機(jī)：湖南湘儀；ΜV2400紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平；XMTD-8222型鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花生莖葉黃酮提取液的制備

黃酮提取的基本流程：花生莖葉→烘干箱干燥→粉碎→過60目篩→乙醇提取→離心→上清液→定容→測定總黃酮含量。

1.3.2 黃酮含量的測定方法

采用分光光度法測定花生莖葉提取液中總黃酮含量，選用蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)對2種顯色方法(亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16]和三氯化鋁法[17])顯色前后的蘆丁和花生莖葉提取液進(jìn)行全波長掃描，以確定適合花生莖葉提取液的顯色方法。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

以乙醇濃度40%，提取時(shí)間2 h，提取溫度60 ℃，液料比15:1為基本提取條件，依次變動(dòng)單個(gè)因素的不同水平，以確定相關(guān)因素對提取液中總黃酮含量的影響。單因素變動(dòng)設(shè)置如下：乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液)，提取時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3和3.5 h)，提取溫度(40、50、60、70、80和90 ℃)，液料比(5:1、10:1、15:1、20:1、25:1和30:1)。

1.3.4 響應(yīng)面分析法對花生莖葉黃酮提取工藝的優(yōu)化

為了得到花生莖葉黃酮提取的最佳工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以花生莖葉黃酮的提取率為考察指標(biāo)。對乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比、提取溫度4個(gè)變量A、B、C、D，進(jìn)行響應(yīng)面分析。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的實(shí)驗(yàn)水平

1.3.5 花生莖葉黃酮的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

按照1.3.4方法中優(yōu)化出的最優(yōu)提取工藝提取花生莖葉黃酮，粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、離心后測定總黃酮濃度。然后將提取液稀釋成不同總黃酮濃度的溶液備用。

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性實(shí)驗(yàn)方法參照Liu等[18]方法進(jìn)行，即將不同濃度的花生莖葉黃酮水溶液(0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg)3 mL或VC陽性對照水溶液(濃度設(shè)置同花生莖葉黃酮)3 mL與1 mL DPPH(10-4mol/L，95%乙醇配制)溶液混勻，置于暗處反應(yīng)40 min，用分光光度計(jì)在517 nm下測定吸光度Ai；用3 mL蒸餾水替代上述提取液或VC溶液，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，測得吸光度Ac；用1 mL 95%乙醇替代上述反應(yīng)中的DPPH溶液，測得吸光度值為Aj，按公式計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

1.3.5.2 羥自由基清除活性[19]

在反應(yīng)體系中依次加入0.6 mL FeSO4(6 mmoL/L)、2.0 mL不同濃度的花生莖葉黃酮溶液或VC溶液和0.6 mL H2O2(6 mmoL/L)，充分震蕩避光靜置10 min，加入0.6 mL水楊酸(6 mmoL/L，無水乙醇配制)充分混合，再靜置10 min，于波長510 nm處測定吸光度A1。保持其他操作不變，用無水乙醇替代上述體系中的水楊酸溶液，測定吸光度值A(chǔ)2。再用蒸餾水代替上述體系中的樣品溶液，測定吸光度值A(chǔ)0。

羥自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 花生莖葉提取液黃酮含量的測定

圖1顯示不同染色方法對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和花生莖葉提取液進(jìn)行顯色后的全波長掃描的吸收光譜結(jié)果對照。由掃描圖譜可知，蘆丁和花生莖葉提取液的亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法得到的圖譜吸收峰不重疊，該顯色方法不適用。二者經(jīng)三氯化鋁顯色后在270 nm處最大吸收峰重疊。故本實(shí)驗(yàn)采用三氯化鋁顯色法測定270 nm處的吸光值，以蘆丁標(biāo)品做參照測定花生莖葉提取液黃酮的含量。

圖1 蘆丁及樣品顯色圖譜

回歸方程為：

y=0.036 5x-0.003 5

式中：x為黃酮濃度/mg/mL；y為吸光度，相關(guān)系數(shù)為R2=0.995 5。

黃酮提取量的公式計(jì)算：

黃酮提取量/mg/g=c×V/m

式中：c為提取液黃酮濃度/mg/mL；V為提取液體積/mL；m為花生莖葉干粉質(zhì)量/g。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

圖2顯示了乙醇濃度對花生莖葉黃酮提取率的影響?？傸S酮的提取率隨著乙醇濃度的增高出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率達(dá)到最大：29.35 mg/g，低乙醇濃度時(shí)提取率的上升較平緩，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%和50%時(shí)黃酮的提取率差異不大。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和節(jié)約原則，選擇40%的乙醇作為提取花生莖葉黃酮的最佳乙醇濃度。

因取代基團(tuán)的數(shù)目、位置和性質(zhì)的不同，黃酮類物質(zhì)分子極性也不同。當(dāng)提取液的極性和黃酮類物質(zhì)的極性相同時(shí)，才能達(dá)到最大溶解度和提取率[20]。不同濃度的乙醇極性不用，這是花生莖葉提取率隨乙醇濃度變化的主要原因。

圖2 乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比和溫度對黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。從0.5～2 h范圍內(nèi)提取率僅有少量上升，超過2 h后，提取率開始下降，下降的速度隨溫度升高而加快。提取2 h時(shí)，花生莖葉中黃酮的提取率達(dá)到最大，為36.96 mg/g。隨水浴時(shí)間繼續(xù)增加，花生莖葉黃酮長時(shí)間受熱引起的破壞增加是提取率下降的主要原因。故此，選擇2 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳提取時(shí)間。

2.2.3 液料比對黃酮提取率的影響

由圖2可知，黃酮的提取率隨液料比增大而增大，在液料比為15:1時(shí)黃酮的提取率達(dá)到最大，為36.1 mg/g。隨著液料比繼續(xù)增大，黃酮的提取率則逐漸降低。在較低液料比時(shí)，溶劑較少，溶出的黃酮類物質(zhì)的濃度迅速增加，這影響了黃酮類物質(zhì)進(jìn)一步有效溶出，導(dǎo)致提取率較低。隨著液料比的增大，黃酮類物質(zhì)能夠更加順利的溶出，這提高了黃酮類物質(zhì)的提取率。但是液料比繼續(xù)增加時(shí)，一些醇溶性非黃酮類雜質(zhì)的溶出量也將隨之而增大，影響了花生莖葉中黃酮的溶出，故而在較大溶劑體積時(shí)，隨著溶劑體積的增大黃酮的提取率反而降低。因此，選擇液料比15:1為花生莖葉黃酮提取的最佳液料比。

2.2.4 提取溫度對黃酮提取率的影響

圖2顯示了黃酮提取率受提取溫度影響的結(jié)果，隨著提取溫度的升高，花生莖葉黃酮的提取率增大，在溫度為70 ℃時(shí)，黃酮的提取率達(dá)到最大，為33.08 mg/g。當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高，花生莖葉黃酮的提取率轉(zhuǎn)而下降。過高的提取溫度對花生莖葉黃酮的破壞以及非黃酮類物質(zhì)溶出量的增加是導(dǎo)致提取率下降主要原因。因此，選擇70 ℃作為花生莖葉黃酮提取的最佳溫度。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對花生莖葉黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

表2(續(xù))

由表2的數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0分析可得回歸方程為Y=34.67-1.61A-1.68B+4.96C+1.10D-0.23AB-0.093AC+7.88AD+3.06BC-5.71BD-2.23CD-2.85A2-3.87B2-3.70C2-3.89D2。

2.3.2 回歸模型的方差分析

采用Design-Expert 8.0軟件，對回歸方程各項(xiàng)的方差作出分析。結(jié)果見表3。

表3 回歸方程的方差分析

由表3可知，該模型極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05；且R2為0.934 6，表明93.46%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用這個(gè)模型進(jìn)行解釋，證明該方程的可信度比較高。本實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)為7.39%，比較低。變異系數(shù)越低則實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性越高，故此本實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性較高，實(shí)驗(yàn)操作可信。該方程為優(yōu)化花生莖葉乙醇提取黃酮的工藝條件提供了一個(gè)良好的模型。響應(yīng)面分析可知A、B、BC具有顯著性(P<0.05)，C、AD、BD具有極顯著性(P<0.01)。

2.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

乙醇與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間和液料比與提取溫度的響應(yīng)曲面分別如圖3～圖5所示。

圖3 乙醇濃度與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面圖

圖4 液料比與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面圖

圖5 液料比與提取溫度的響應(yīng)曲面圖

由圖3可知，乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用極顯著，花生莖葉黃酮的提取量隨著乙醇濃度和提取時(shí)間的增加而增加，由曲面圖上可知，較高的乙醇濃度和較長的提取時(shí)間有利于黃酮的浸出。由圖4和圖5可知，液料比與提取溫度、提取時(shí)間的交互作用均顯著，在液料比較小的情況下，提取時(shí)間要很久，才能使黃酮的提取率較高。反之在提取時(shí)間較短的情況下，需要有一個(gè)較大的液料比才能達(dá)到較為理想的黃酮提取效果；在液料比不變的情況下，黃酮的提取率隨著溫度的升高而增大，但太高的溫度和液料比則會(huì)使得黃酮的提取率降低。以上結(jié)果與二次回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 最佳工藝提條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)二次線性回歸方程的分析結(jié)果，花生莖葉黃酮提取的最優(yōu)條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)49.19%、液料比10.16:1、提取溫度為66.56 ℃、提取時(shí)間為2.43 h，黃酮的預(yù)測得率為37.66 mg/g。在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到操作性，確定花生莖葉黃酮的提取工藝為：乙醇濃度為49%、液料比為10:1、提取溫度為67 ℃、提取時(shí)間為2.4 h。采用上述條件，重復(fù)3組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，黃酮提取率為(37.32±0.12)mg/g，與預(yù)測值基本相符，表明模型正確，適用于花生莖葉黃酮提取工藝的優(yōu)化。

2.4 花生莖葉體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除活性

從圖6花生莖葉黃酮和VC對DPPH自由基的清除活性對比圖中可以看出，二者對DPPH自由基的清除活性都隨濃度的增加而增強(qiáng)，花生莖葉黃酮的DPPH自由基清除活性整體稍低于VC。質(zhì)量濃度為125 μg/mL的花生莖葉黃酮對DPPH自由基清除率為78%，當(dāng)質(zhì)量濃度增加至500 μg/mL時(shí)，清除率上升到83.2%，其對DPPH自由基的清除活性的EC50為21.28 μg/mL，遠(yuǎn)低于10 mg/mL，這說明花生莖葉黃酮具有很好的抗氧化活性[21]。

圖6 花生莖葉黃酮清除DPPH自由基活性圖

2.4.2 羥自由基清除活性

圖7顯示了花生莖葉黃酮和VC對羥自由基的清除活性對比。由圖7可知，羥自由基的清除活性與濃度也呈正相關(guān)，花生莖葉黃酮和VC質(zhì)量濃度在15 μg/mL以下時(shí)，二者對羥自由基的清除活性都較低且差異不顯著，隨濃度增加VC對羥自由基的清除活性增長稍快于花生莖葉黃酮，在250 μg/mL時(shí)VC的清除活性達(dá)到99.9%，此時(shí)花生莖葉黃酮的清除活性為85.4%，但在質(zhì)量濃度達(dá)到500 μg/mL以后，二者的羥自由基清除活性都可達(dá)99.9%以上。所以花生莖葉黃酮具有很好的清除羥自由基活性。

圖7 黃生莖葉黃酮清除羥自由基活性

花生莖葉中黃酮類物質(zhì)含量豐富，易于提取。上述抗氧化實(shí)驗(yàn)也表明了花生莖葉黃酮類物質(zhì)具有很好的抗氧化活性。今后可在不同食品的加工過程中添加花生莖葉黃酮，考察其對不同食品加工過程和貨架期內(nèi)食品品質(zhì)影響及其對食品的抗氧化效果表現(xiàn)，研究花生莖葉黃酮作為食品抗氧化劑的使用范圍[22]。

3 結(jié)論

通過體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花生莖黃酮對羥自由基和DPPH自由基都有較好的清除能力。當(dāng)花生莖葉黃酮質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，其對DPPH自由基的清除活性為：83.2%，對羥自由基的清除活性為99.9%，這說明花生莖葉黃酮具有較好的體外抗氧化活性，是很好的天然抗氧化劑。提取工藝優(yōu)化的結(jié)果顯示：乙醇體積分?jǐn)?shù)49%、液料比10:1、提取溫度67 ℃、提取時(shí)間2.4 h，為提取花生莖葉黃酮的最佳條件。此條件下黃酮提取率可達(dá)(37.32±0.12) mg/g，說明花生莖葉中黃酮類物質(zhì)含量較大，是優(yōu)質(zhì)天然抗氧化劑的理想材料來源。

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