輻照與粉碎對玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率的影響

郭棟豪，陳 亮，武小芬，齊 慧，王克勤*

(1.湖南大學隆平分院，湖南長沙410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學院 核農(nóng)學與航天育種研究所農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術研究中心，湖南長沙410125)

木質(zhì)纖維素燃料乙醇具有可再生、清潔環(huán)保的優(yōu)勢，對于緩解能源危機、氣候變暖、環(huán)境污染具有重要意義［1-2］。玉米秸稈是我國僅次于水稻秸稈的第二大作物秸稈，具有產(chǎn)量大、價格低廉等特點［3］?，F(xiàn)階段，玉米秸稈的主要利用方式為秸稈還田(直接、間接)、畜牧業(yè)飼料、工業(yè)利用(造紙、建材)、生物燃料等，其中利用玉米秸稈生產(chǎn)燃料乙醇是清潔生產(chǎn)的主要發(fā)展方向，其工藝流程為:預處理—糖化—發(fā)酵—純化［4］。但玉米秸稈主要由結構致密的木質(zhì)纖維素(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)組成，纖維素、半纖維素被木質(zhì)素包裹其中，分子結晶度高，直接進行水解還原糖得率極低，因此，需先對原材料進行預處理，增加纖維原料多孔性，提高水解反應的糖得率［4-5］。木質(zhì)纖維素預處理方法主要有生物法(白腐菌、褐腐菌和軟腐菌等)、化學法(酸處理、堿處理、臭氧解等)、物理法(精磨、高壓、熱水、微波、射線等)、物理化學法等［4-13］。但這些預處理方法均存在一些不足，無法滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高效、清潔的生產(chǎn)要求，如生物法預處理耗時長，堿處理污染環(huán)境，酸水解會產(chǎn)生抑制糖化發(fā)酵的副產(chǎn)物，精磨能耗高，蒸汽爆破對設備要求高等［10-19］。γ射線輻照預處理在常溫常壓下進行，具有環(huán)境友好、能耗低、抑制物少、轉化率高等優(yōu)勢，目前已廣泛應用于木質(zhì)纖維素材料的預處理［20-24］。一般認為，輻照預處理可以破壞生物質(zhì)結構，從而提高其酶解效率。易錦瓊［25］研究表明，隨著輻照劑量的增大玉米秸稈結晶度逐漸降低，2 000 kGy輻照處理時，結晶度由未經(jīng)輻照的 22.64%降低至 3.85%。Liu 等［26］、蔣怡樂等［27］認為，微晶纖維素聚合度隨著預處理輻照劑量的提高而降低，即輻照劑量越高，降解程度越高。陳靜萍等［28］研究表明，隨著輻照劑量的提高，稻草酶解纖維素轉化率逐漸提高，當輻照劑量為1 500 kGy時，纖維素轉化率由未輻照的19.5%提高至88.7%。

輻照對木質(zhì)纖維素材料粒徑也有影響，在一定輻照劑量范圍內(nèi)，隨著輻照劑量的提高，小顆粒所占比重逐漸增大。唐洪濤等［29-31］研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈經(jīng)輻照預處理后，其粒徑向細顆粒方向遷移，800 kGy處理秸稈粒度＜75 μm的顆粒占比由7.60%(未輻照)增大到 42.4%，沈志強［32］、楊春平等［33］利用輻照預處理麥秸時也得到了一致的結論。陳軍等［34］研究表明，隨著玉米秸稈粒徑的減小，其酶解還原糖得率提高，酶解不同粒徑的秸稈微觀形貌也有一定的差異。但輻照劑量與粉碎粒徑對木質(zhì)纖維素酶解轉化率是否存在協(xié)同效應，目前還沒有文獻報道。鑒于此，以玉米秸稈為材料，經(jīng)過不同劑量的輻照、粉碎處理后，以粒徑和酶解葡聚糖轉化率為主要指標，研究輻照和粉碎對秸稈類木質(zhì)纖維素酶解轉化率的影響，旨在為基于輻照技術的秸稈能源化利用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及設計

供試玉米(品種為中單3880)秸稈(稈和葉)為2016年湖南省作物研究所秋季秸稈，輻照劑量設置為 0(對照)、400、800 kGy，粒徑設置為 r＞0.450 mm、0.180 mm＜r＜0.450 mm、0.125 mm＜r＜0.180 mm、0.075 mm＜r＜0.125 mm、r＜0.075 mm，試驗于 2017 年 4 月26日—7月6日在湖南省農(nóng)業(yè)科學院核農(nóng)學與航天育種研究所進行。

試劑:D–無水葡萄糖(Sigma)、D–木糖(Rubibio)、纖維素酶(北京高瑞森科技有限公司)、硫酸(衡陽市凱信化工試劑股份有限公司)、甲醇(安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?、乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)、無水乙酸鈉(天津大茂化學試劑廠)，均為分析純。

供試儀器:中草藥粉碎機(FW177，天津市泰斯特儀器有限公司)、電熱恒溫鼓風干燥器(GZX－9246MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、恒溫搖床(HZQ－F100，常州諾基儀器有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌箱(YXQ－LS－50S11，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、臺式高速離心機(TG16－Ⅱ，長沙平凡儀器儀表有限公司)。

輻射源:60Co，源強 2.96×1016Bq。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 玉米秸稈收獲后，自然曬干，切成5 cm左右的小段，每個處理2 kg，裝入金屬樣品盒，常溫下進行輻照。取0、400、800 kGy輻照的玉米秸稈各100 g，用中草藥粉碎機在24 000 r/min下粉碎 30 s，依次過 0.450、0.180、0.125、0.075 mm 篩，收集粒徑 r＞0.450 mm、0.180 mm＜r＜0.450 mm、0.125 mm＜r

＜0.180 mm、0.075 mm＜r＜0.125 mm、r＜0.075 mm 的樣品并稱質(zhì)量。

1.2.2 水提與水提液酸水解 取上述粒徑的0、400、800 kGy輻照玉米秸稈 3 g(精確至 0.000 1 g)置于具塞三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，于50℃、200 r/min條件下提取2 h后過濾，濾渣烘干至恒質(zhì)量，濾液測定葡萄糖和木糖含量，同時取上清液14 mL，加入0.5 mL 72%硫酸，置于高壓滅菌鍋中，121℃條件下反應1 h后離心，取上清液測定酸水解后水提液中葡萄糖和木糖含量，計算樣品中可溶性葡聚糖、木聚糖含量［35］，公式如下:

可溶性葡聚糖含量=(水提液酸水解后葡萄糖含量－水提液葡萄糖含量)×0.9/樣品質(zhì)量×100%，

可溶性木聚糖含量=(水提液酸水解后木糖含量－水提液木糖含量)×0.88/樣品質(zhì)量×100%。

1.2.3 水提液濾渣酸水解 水提后烘干濾渣，稱取0.3 g(精確至0.000 1 g)，加入3 mL 72%硫酸，30 ℃水浴條件下反應1 h，加入84 mL蒸餾水，置于高壓滅菌鍋中121℃條件下反應1 h，然后取出冷卻過濾，收集濾液，測定葡萄糖、木糖含量，計算樣品中不溶性葡聚糖和木聚糖含量［35］。

不溶性葡聚糖含量=濾渣酸水解后葡萄糖含量×0.9/樣品質(zhì)量×100%，

不溶性木聚糖含量=濾渣酸水解后木糖含量×0.88/樣品質(zhì)量×100%。

1.2.4 酶解 稱取不同粒徑的0、400、800 kGy輻照的玉米秸稈2.0 g于具塞三角瓶中，按固液比1∶15加入30 mL 0.1 mol/L的乙酸–乙酸鈉緩沖液(pH值為4.8)，纖維素酶加入量為 20 FPU/g，搖勻后置于50℃、130 r/min條件下進行酶解反應。在反應時間24、48、72、96 h 各取樣 0.5 mL，離心后取上清液 0.2 mL，加入 0.8 mL 0.005 mol/L 硫酸溶液，測定葡萄糖和木糖含量，計算酶解葡聚糖轉化率。

葡聚糖含量=可溶性葡聚糖含量+不可溶性葡聚糖含量，

葡聚糖轉化率=(酶解液葡萄糖含量－水提液葡萄糖含量)×0.9/樣品葡聚糖含量×100%。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 纖維素酶活 根據(jù) Ghose［36］的濾紙底物法(FPA)測定纖維素酶活，其中以高效液相色譜(HPLC)代替3，5–二硝基水楊酸法來測定還原糖濃度。

1.3.2 葡萄糖、木糖含量 參照陳亮等［35］采用HPLC法測定。色譜條件為流動相 0.005 mol/L H2SO4、流速 0.600 mL/min、柱溫 55 ℃，色譜柱為Aminex HPX－87H，檢測器為示差折光檢測器。

1.3.3 輻照劑量與粉碎粒徑交互作用對葡聚糖酶解轉化率的影響 首先對以葡聚糖轉化率為因變量、輻照劑量和粉碎粒徑為影響因子的試驗數(shù)據(jù)做兩因素方差分析，判斷輻照劑量與粉碎粒徑之間是否存在交互作用。在兩者具有交互作用前提下，用S值來判斷相互作用的性質(zhì)，用A值大小來度量交互作用的強弱，計算公式:

各公式符號意義見表1。

表1 符號說明

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Duncan氏法進行多重比較，采用Origin 8.0軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 輻照對玉米秸稈粒度分布的影響

由圖1可知，與對照(0 kGy)相比，輻照處理后粒徑 r＞0.450 mm、0.180 mm＜r＜0.450 mm 的顆粒含量隨輻照劑量提高顯著減小;粒徑r＜0.075 mm范圍內(nèi)的秸稈顆粒所占比重隨輻照劑量提高而顯著增加，0、400、800 kGy輻照劑量的玉米秸稈在同一粉碎條件下獲得粒徑r＜0.075 mm顆粒的比重依次為15.03%、53.22%、63.09%，400、800 kGy 輻照處理較對照分別顯著增加38.19、48.06個百分點，即樣品中小顆粒比重隨輻照劑量的增大而增大。說明輻照處理的玉米秸稈其粉碎后的粒徑向小顆粒方向遷移。

圖1 輻照對玉米秸稈粒徑分布的影響

2.2 輻照對玉米秸稈葡聚糖和木聚糖含量的影響

由表2可知，0、400、800 kGy輻照處理水提液中葡萄糖和木糖含量均較低，0 kGy輻照處理葡萄糖、木糖含量均隨粒徑減小而提高，400 kGy輻照處理葡萄糖和木糖含量隨粒徑減小而降低，800 kGy輻照處理各粒徑間無明顯規(guī)律。與酸水解前樣品相比，酸水解后0、400、800 kGy輻照處理葡萄糖和木糖含量分別提高了 0.01～8.10、2.66～8.32、9.99～17.36倍和 0.94～1.95、2.06～4.79、8.39～10.67 倍，且提高幅度隨著輻照劑量升高而增加。不同輻照劑量下，各粒徑樣品中可溶性葡聚糖和木聚糖含量表現(xiàn)為800 kGy＞400 kGy＞0 kGy。同一粒徑不同輻照劑量下，葡聚糖和木聚糖含量均存在顯著差異，且與對照相比，800 kGy輻照處理葡聚糖、木聚糖含量分別提高了 14.01～426.00、3.17～5.99倍。

表2 輻照對玉米秸稈葡聚糖和木聚糖含量的影響 mg/g

2.3 粉碎粒徑與輻照劑量對玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率的影響

2.3.1 粉碎粒徑的影響 由圖2可知，未輻照玉米秸稈其酶解葡聚糖轉化率隨著粒徑的減小呈升高趨勢，且不同粒徑間葡聚糖轉化率差異顯著。當粒徑由r＞0.450 mm 減小到 r＜0.075 mm 時，其酶解葡聚糖轉化率由16.01%提高至 30.25%，顯著增加了 14.24個百分點。400 kGy輻照處理的玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率隨粒徑的減小而提高，當粒徑由r＞0.450 mm減小到 r＜0.075 mm 時，其酶解葡聚糖轉化率由31.54%提高至59.71%，顯著增加了 28.17個百分點。除 0.180 mm＜r＜0.450 mm 與 0.125 mm＜r＜0.180 mm 的酶解葡聚糖轉化率無顯著差異外，其余粒徑間差異顯著。800 kGy輻照處理的玉米秸稈不同粒徑間酶解葡聚糖轉化率無顯著差異。

2.3.2 輻照劑量的影響 由圖3可知，不同粒徑范圍內(nèi)，玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率均隨輻照劑量的增加而提高，輻照處理葡聚糖轉化率較對照顯著提高 15.53～46.80 個百分點。除粒徑 r＜0.075 mm 外，其余粒徑下，不同輻照處理間差異顯著。粒徑r＜0.075 mm在400、800 kGy輻照處理下葡聚糖轉化率顯著高于對照，但兩者間無顯著差異。400 kGy處理的最佳粒徑為r＜0.075 mm，此時葡聚糖轉化率較對照提高了29.46個百分點;800 kGy處理的最佳粒徑為r＞0.450 mm，此時葡聚糖轉化率較對照提高了46.80 個百分點。

圖2 粉碎粒徑對玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率的影響

圖3 輻照劑量對玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率的影響

2.3.3 輻照劑量與粉碎粒徑交互作用的影響 由輻照劑量與粉碎粒徑對玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率影響試驗的兩因素方差分析可知，輻照劑量、粉碎粒徑及兩者交互對玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率均有顯著影響。400 kGy輻照時，粉碎粒徑與輻照劑量對玉米秸稈葡聚糖轉化率呈協(xié)同作用，粉碎粒徑由r＞0.450 mm 分別減小至 0.180 mm＜r＜0.450 mm、0.125 mm＜r＜ 0.180 mm、0.075 mm ＜r＜ 0.125 mm、r＜ 0.075mm時，協(xié)同作用較強，增長率依次為42.80%、39.95%、34.65%、46.82%;800 kGy 輻照時，粒徑由0.180 mm＜r＜0.450 mm 減小至 0.125 mm＜r＜0.180 mm時，粉碎粒徑與輻照劑量對玉米秸稈葡聚糖轉化率呈協(xié)同作用，其余粉碎粒徑與輻照劑量對玉米秸稈葡聚糖轉化率有拮抗作用(表3)。400 kGy和800 kGy輻照劑量與粉碎粒徑交互作用相對于單獨輻照和單獨粉碎處理增長率分別為0.24%～46.82%和－26.90%～0.42%。

表3 輻照劑量與粉碎粒徑交互作用對玉米秸稈酶解葡聚糖轉化率的影響

3 結論與討論

輻照預處理對木質(zhì)纖維素微觀形貌、化學組分、熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性等理化特性產(chǎn)生影響［21-22，25-26］。本研究結果表明，0～800 kGy 輻照處理后玉米秸稈中的小顆粒所占比重隨著輻照劑量的增加而增大，這與前人的研究結果［26-30］一致。易錦瓊［25］利用掃描電鏡觀察0～2 000 kGy輻照劑量處理后的玉米秸稈微觀形貌發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈表面出現(xiàn)溝痕和坑穴，結構變得疏散，在1 600～2 000 kGy輻照下，纖維原有整齊束狀結構被打斷，扭曲成蜂窩狀，因此，更加易于粉碎獲得細小顆粒。本研究中，各輻照劑量樣品水提液中葡萄糖和木糖含量均較低，水提液酸水解后葡萄糖和木糖含量均增加，且增加倍數(shù)隨著輻照劑量的提高而增大，原因可能是輻照作用將玉米秸稈總纖維素降解為可溶性聚糖，提高了可溶性葡萄糖和木糖含量，進而提高了秸稈酶解轉化率。0、400 kGy輻照處理的秸稈酶解轉化率隨粉碎粒徑的減小而提高，輻照劑量和粉碎粒徑對酶解葡聚糖轉化率有顯著影響，且大多為協(xié)同作用，這與前人研究結果［29-33］一致。一般認為，粉碎的機械力對纖維的沖擊和剪切作用可破壞纖維原有結構使其比表面積增加，從而提高纖維素酶與底物分子結合的概率，進而提高了酶解轉化率［37-38］，但800 kGy輻照的玉米秸稈不同粒徑酶解轉化率無顯著差異，且輻照與粉碎粒徑幾乎沒有協(xié)同作用。說明此時輻照的影響已經(jīng)遠遠大于粉碎，這可能是當輻照劑量增大到一定程度，玉米秸稈結構發(fā)生破壞，導致粗顆粒內(nèi)部產(chǎn)生多孔性結構，從而增加其比表面積，提高了酶與底物的接觸概率。有學者研究發(fā)現(xiàn)，采用掃描電鏡研究輻照微晶纖維素、木聚糖和半纖維素表觀結構時發(fā)現(xiàn)，當劑量大于800 kGy時，微晶纖維素、木聚糖以及半纖維素表面變得粗糙，出現(xiàn)許多孔洞或裂紋［39-41］，說明輻照劑量較大時，木質(zhì)纖維素材料會出現(xiàn)疏松多孔結構，從而提高其酶解效率。

0、400 kGy輻照下的玉米秸稈，粉碎粒徑越小，酶解轉化率越高，這在優(yōu)化預處理和酶解糖化工藝等方面具有一定價值。但800 kGy輻照下玉米秸稈不同粒徑酶解轉化率無顯著差異，其機制有待進一步研究。

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