頭穴透刺對(duì)腦出血大鼠腦組織中脾酪氨酸激酶表達(dá)的影響*

劉曉瑩，鄒 偉，于學(xué)平

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)作為一種致命性的中風(fēng)，全世界范圍內(nèi)每年約有200萬人患病[1-4]?，F(xiàn)有的治療方法在改善患者預(yù)后方面療效不理想，炎癥反應(yīng)在ICH導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷中作用尤為重要[5-7]。所以識(shí)別ICH后炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，有效調(diào)控炎癥反應(yīng)將為治療腦出血提供新方向[8]。脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，SYK)作為蛋白酪氨酸激酶(PTK)家族的成員，是一種非受體型酪氨酸激酶[9]。作為治療炎癥和自身免疫性疾病的有效靶點(diǎn)，SYK已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)參與了中風(fēng)、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[10-13],已成為醫(yī)學(xué)研究的新熱點(diǎn)。針灸作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在降低中風(fēng)患者致殘率、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等方面的療效顯著，已在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可[14-15]，但其機(jī)理尚未完全清楚。已有研究證實(shí)針刺“百會(huì)”透“曲鬢”具有拮抗腦出血炎性腦損傷的作用[16]，筆者采用自體血輸注法制備大鼠腦出血模型，觀察針刺“百會(huì)”透“曲鬢”穴對(duì)腦出血大鼠SYK表達(dá)的影響，從而揭示“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法治療急性期腦出血的作用及可能的作用機(jī)制，以期為針灸治療腦出血提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

臺(tái)式牙鉆機(jī)(中國上海齒科醫(yī)械廠,307-6型)；立體定位儀(中國成都儀器廠,STW-1型)；低溫冷凍離心機(jī)(德國Thermo公司,002421)；電泳儀(美國BIO-RAD公司,1645070)；切片機(jī)(德國菜卡公司,2135)；顯微攝影成像系統(tǒng)(美國moticam公司,3000)；Rabbit Anti-SYK antibody (Bioss, bs-0685R)；Mouse Anti-beta-Actin antibody(Bioss,bsm-33036M)。

1.2 動(dòng)物分組

從哈爾濱獸醫(yī)研究所購得成年雄性SD大鼠156只，SPF級(jí)，體質(zhì)量280～320 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=12)、模型組(n=48)、抑制劑組(n=48)和針刺組(n=48)；每組按術(shù)后6 h、12 h、24 h和72 h分為4個(gè)亞組(n=12)。

1.3 腦出血模型制備

腦出血模型：戊巴比妥(60 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于立體定位儀上，頭皮中線切口，暴露前囟點(diǎn)和冠狀縫。定于前囟點(diǎn)后側(cè)0.2 mm與右側(cè)3.5 mm交匯處，用直徑1 mm牙科鉆鉆孔至硬腦膜表面；取大鼠自體尾尖血50 μL，以20 μL/min速度注入尾殼核(AP:0.24 mm, L:3.5 mm, D:6 mm)[17]，留針5 min后退出微量注射器。牙科水泥封孔，縫合、包扎、消毒。根據(jù)Zea Longa[18]的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，1～3分表明造模成功。

假手術(shù)動(dòng)物模型：大鼠接受與模型組相同的各項(xiàng)操作，斷尾取尾尖血50 μL，微量注射器進(jìn)針后不注血，留針5 min后退針。

1.4 干預(yù)方法

針刺組：百會(huì)、曲鬢穴定位參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》,常規(guī)剪毛消毒，以0.30 mm×25 mm針灸針快速刺入百會(huì)穴帽狀腱膜下，并向右下方曲鬢穴透刺，進(jìn)針深度15 mm，以200轉(zhuǎn)/min小幅度捻轉(zhuǎn)，每捻針5 min后間隔5 min，反復(fù)操作，共留針30 min。每12 h針刺1次。

假手術(shù)和模型組：在針刺治療相應(yīng)時(shí)間內(nèi)抓取固定1次，固定30 min，不做任何處理。

抑制劑組：腦出血造模后1 h腹腔注射Piceatannol(34.62 mg/kg)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)估 分別在造模后6 h、12 h、24 h、72 h應(yīng)用mNSS評(píng)分系統(tǒng)[19]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.5.2 免疫組化 戊巴比妥(60 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌流，大鼠斷頭取腦，多聚甲醛后固定，脫水，石蠟包埋，腦組織切片(5 μm)。美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)，每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取血腫周圍區(qū)5個(gè)非重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)的平均值[20]。

1.5.3 Western Blot 分別取腦出血(ICH)后6 h、12 h、24 h和72 h實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)(出血側(cè))大腦半球，裂解腦組織；取總蛋白50 μg； SDS-PAGE 電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用5%的脫脂牛奶阻封閉，進(jìn)行一抗孵育、二抗孵育；DAB試劑盒顯色，將膜置于掃描儀中掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值[21]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用Graph Pad Prism6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。神經(jīng)功能評(píng)分、免疫組化、western Blot及ELISA結(jié)果應(yīng)用單因素方差分析結(jié)合Tukey檢驗(yàn)，顯著性差異為P<0.05 。

2 結(jié)果

2.1 針刺治療對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能影響

如表1所示，與假手術(shù)組相比各時(shí)間點(diǎn)模型組mNSS評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比相同時(shí)間點(diǎn)針刺組與抑制劑組評(píng)分明顯降低(P<0.05)；針刺組與抑制劑組組間比較無顯著差異(P>0.05)。

2.2 針刺治療對(duì)腦出血大鼠SYK水平的影響

2.2.1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織SYK免疫組化結(jié)果 腦組織中SYK主要在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果如表2 所示，與假手術(shù)組相比，模型組SYK水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比同一時(shí)間點(diǎn)針刺組、抑制劑組SYK水平顯著降低(P<0.05)，針刺組與抑制劑組組間比較無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織SYK蛋白水平 如圖1、表3所示，與假手術(shù)組相比，模型組SYK水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比同一時(shí)間點(diǎn)針刺組、抑制劑組SYK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，針刺組與抑制劑組組間比較無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分情況比較

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與抑制劑組比較，③P>0.05

表2 各組大鼠血腫周圍腦組織SYK陽性細(xì)胞數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與抑制劑組比較，③P>0.05

圖1 各組大鼠血腫周圍腦組織SYK蛋白水平比較 注：1.假手術(shù)組6 h;2.模型組6 h;3.抑制劑組6 h;4.針刺組6 h;5.假手術(shù)組12 h;6.模型組12 h;7.抑制劑組12 h;8.針刺組12 h;9.假手術(shù)組24 h;10.模型組24 h;11.抑制劑組24 h;12.針刺組24 h；13.假手術(shù)組72 h;14.模型組72 h;15.抑制劑組72 h;16.針刺組72 h

組別例數(shù)ICH6hICH12hICH24hICH72h假手術(shù)組60．58±0．160．58±0．160．58±0．160．58±0．16模型組241．0±0．17①1．02±0．17①1．23±0．13①1．06±0．22①抑制劑組240．75±0．14②0．80±0．11②0．90±0．20②0．77±0．11②針刺組240．75±0．16②③0．80±0．10②③0．93±0．20②③0．85±0．14②③

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與抑制劑組比較，③P>0.05

3 討論

脾酪氨酸激酶(SYK)屬于蛋白酪氨酸激酶(PTK)家族中的成員，是一種非受體型酪氨酸激酶[22]。人類SYK基因定位于第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂q22上，包含有629個(gè)氨基酸，分子量為72 kD。SYK具有三磷酸腺苷(ATP)的結(jié)合位點(diǎn)和自磷酸化的酪氨酸殘基，含有2個(gè)串聯(lián)的SH2結(jié)構(gòu)域及1個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域SH1。SYK通過SH2區(qū)域與依賴?yán)野彼岬拿庖呤荏w活化基序(Immu-noreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)結(jié)合而活化，作為免疫受體的關(guān)鍵介質(zhì)在炎性細(xì)胞中表達(dá)[23-29]。

SYK廣泛存在于造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞上，有抑制細(xì)胞增殖分裂、影響細(xì)胞因子分泌、影響細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)功能[13,22]。SYK磷酸化活化，發(fā)生構(gòu)象改變，并參與NF-kB、Akt等多個(gè)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)的活化，導(dǎo)致細(xì)胞分化、凋亡、增殖異常，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[30-31]。腦出血后，血液大量累積，激發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，使單核細(xì)胞浸潤(rùn)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化,血腦屏障破壞，加重腦水腫，造成嚴(yán)重的腦損傷[32-33]。Yue He等[34]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)大鼠腦組織中SYK水平顯著升高，應(yīng)用SYK抑制劑進(jìn)行干預(yù)，可有效減少炎性細(xì)胞因子生成，減輕腦水腫程度，有效改善了SAH后大鼠神經(jīng)功能損傷。也有研究表明，SYK參與了小鼠缺血性中風(fēng)的病理過程，SYK抑制劑可有效縮小病灶體積，減輕腦水腫[25]。對(duì)于有著相同結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和相似生理病理機(jī)制的腦出血，SYK在其發(fā)病機(jī)制及治療中的作用還未得到廣泛關(guān)注。因此，研究SYK在腦出血中的表達(dá)情況，尋找特異性的抑制劑，調(diào)控免疫反應(yīng)激活，將為腦出血的治療提供新的思路。

頭皮針刺法是在中國傳統(tǒng)針灸理論基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代解剖學(xué)、病理生理學(xué)知識(shí)發(fā)展而來的一種新型針刺療法。在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，針刺“百會(huì)”透“曲鬢”可以通過促進(jìn)腦出血急性期內(nèi)源性GDNF表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)重塑作用[35]；通過抑制Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的再生和修復(fù)[36]；并且通過抑制NF-kB經(jīng)典通路，有效拮抗腦出血炎性腦損傷[16]。在這項(xiàng)研究中，筆者發(fā)現(xiàn)針刺組大鼠mNSS評(píng)分明顯降低，可見“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法治療腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷的有效性。腦出血后大鼠腦組織中SYK表達(dá)明顯增多，與模型組相比針刺組SYK水平顯著降低，且針刺組與抑制劑組療效無顯著差異，由此推斷針刺“百會(huì)”透“曲鬢”可能是通過抑制SYK表達(dá)來調(diào)控腦出血后神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而有效改善腦出血引起的神經(jīng)功能損傷。

綜上所述，“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法治療腦出血可能的作用機(jī)制之一是通過降低腦出血引起的脾酪氨酸激酶的升高，抑制下游炎癥通路，減少相關(guān)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕腦損傷。由于針刺治療具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)，并非單純作用一條路徑。本研究首次提出針刺可能以SYK為干預(yù)靶點(diǎn)，拮抗腦出血后炎性腦損傷的假設(shè)，并通過實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證。然而SYK參與腦出血炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和發(fā)現(xiàn)，這將為治療腦出血神經(jīng)功能損傷提供新思路。

[1] Qureshi AI，Mendelow AD，Hanley DF.Intracerebral haemorrhage[J].The Lancet，2009，373(9675):1632-1644.

[2] Broderick J，Connolly S，F(xiàn)eldmann E,et al.Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage in adults: 2007 update: a guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group[J].Circulation，2007，116(16):e391-413.

[3] Lloyd-Jones D，Adams R，Carnethon M,et al.Heart disease and stroke statistics——2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee[J].Circulation，2009，119(3):480-486.

[4] Sudlow CL，Warlow CP.Comparable studies of the incidence of stroke and its pathological types: results from an international collaboration International Stroke Incidence Collaboration[J].Stroke，1997，28(3):491-499.

[5] Mayer SA，Rincon F.Treatment of intracerebral haemorrhage[J].Lancet Neurol，2005，4(10):662-672.

[6] Keep RF，Hua Y，Xi G.Intracerebral haemorrhage: mechanisms of injury and therapeutic targets[J].Lancet Neurol，2012，11(8):720-731.

[7] Zhou Y，Wang Y，Wang J,et al.Inflammation in intracerebral hemorrhage: from mechanisms to clinical translation[J].Prog Neurobiol，2014，115:25-44.

[8] Zhao X，Sun G,Zhang J，et al.Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: role for peroxisome proliferator-activated receptor gamma in microglia/macrophages[J].Ann Neurol，2007，61(4):352-362.

[9] Singh R，Masuda ES，Payan DG.Discovery and develop-ment of spleen tyrosine kinase (SYK) inhibitors[J].J Med Chem，2012，55(8):3614-3643.

[10] Bijli KM，F(xiàn)azal F，Minhajuddin M，et al.Activation of Syk by protein kinase C-delta regulates thrombin-induced intercellular adhesion molecule-1 expression in endothelial cells via tyrosine phosphorylation of RelA/p65[J].J Biol Chem，2008，283(21):14674-14684.

[11] Masuda ES，Schnitz J.SYK inhibitors as treatment for allergic rhinitis[J].Pulm Pharmacol Ther，2008，21(3):461-467.

[12] Chakraborty G，Rangaswami H，Jain S，et al.Hypoxia regulates cross-talk between Syk and Lck leading to breast cancer progression and angiogenesis[J].J Biol Chem，2006，281(16):11322-11331.

[13] 孫麗，甘我挺，韓欣，等.脾酪氨酸激酶—?jiǎng)用}粥樣硬化新靶點(diǎn)及其藥物研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(5): 608-612.

[14] Meng X，Xu S，Lao L.Clinical acupuncture research in the West[J].Front Med，2011，5(2):134-140.

[15] Liu W，Wang X，Yang S，et al.Electroacupunctre improves motor impairment via inhibition of microglia-mediated neuroinflammation in the sensorimotor cortex after ischemic stroke[J].Life Sci，2016，151:313-322.

[16] Liu H，Sun XW,Zou W，et al.Scalp acupuncture attenuates neurological deficits in a rat model of hemorrhagic stroke[J].Complement Ther Med，2017，32:85-90.

[17] George P，Charles W.The rat brain in stereotaxic coordinates[M].6th ed.Burlington:Academic Press，2008:101-102.

[18] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1):84-91.

[19] Lei C，Wu B，Cao T，et al.Activation of the high-mobility group Box 1 protein-receptor for advanced glycation end-products signaling pathway in rats during neurogenesis after intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2015，46(2):500-506.

[20] Xue X，You Y，Tao J，et al.Electro-acupuncture at points of Zusanli and Quchi exerts anti-apoptotic effect through the modulation of PI3K/Akt signaling pathway[J].Neurosci Lett,2014，558:14-19.

[21] Duris K，Manaenko A，Suzuki H，et al.α7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987 attenuates early brain injury in a perforation model of subarachnoid hemorrhage in rats[J].Stroke，2011，42(12):3530-3536.

[22] 劉細(xì)國，袁先厚，江普查.脾酪氨酸激酶在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2010，15(8):484-486.

[23] Spurgeon SE，Coffey G，F(xiàn)letcher LB，et al.The selective SYK inhibitor P505-15 (PRT062607) inhibits B cell signaling and function in vitro and in vivo and augments the activity of fludarabine in chronic lymphocytic leukemia[J].J Pharmacol Exp Ther，2013，344(2):378-387.

[24] Ifrim DC，Joosten LA， Kullberg BJ.Candida albicans primes TLR cytokine responses through a Dectin-1/Raf-1-mediated pathway[J].J Immunol，2013，190(8):4129-4135.

[25] Stepanek O，Draber P，Drobek A.Nonredundant roles of Src-family kinases and Syk in the initiation of B-cell antigen receptor signaling[J].J Immunol，2013，190(4):1807-1818.

[26] Abbal C，Lambelet M，Bertaggia D，et al.Lipid raft adhesion receptors and Syk regulate selectin-dependent rolling under flow conditions[J].Blood，2006，108(10):3352-3359.

[27] Nag A，F(xiàn)aeder JR，Goldstein B.Shaping the response: the role of FcεRI and Syk expression levels in mast cell signaling[J].IET Syst Biol，2010，4(6):334-347.

[28] Nag A，Monine MI，Blinov ML，et al.A detailed mathematical model predicts that serial engagement of IgE-Fc epsilon RI complexes can enhance Syk activation in mast cells[J].J Immunol，2010，185(6):3268-3276.

[29] Kerrigan AM，Brown GD.Syk-coupled C-type lectins in immunity[J].Trends Immunol，2011，32(4):151-156.

[30] Sekuli A，Hudson CC，Homme JL，et al.A direct linkage between the phosphoinositide 3-kinase-AKT signaling pathway and the mammalian target of rapamycin in mitogen-stimulated and transformed cells[J].Cancer Res，2000，60(13):3504-3513.

[31] Ruland J，Mak TW.Transducing signals from antigen receptors to nuclear factor kappaB[J].Immunol Rev，2003，193:93-100.

[32] Aronowski J，Hall CE.New horizons for primary intracerebral hemorrhage treatment: experience from preclinical studies[J].Neurol Res，2005，27(3):268-279.

[33] Wang J，Dore S.Inflammation after intracerebral hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(5):894-908.

[34] He Y，Xu L，Li B，et al.Macrophage-Inducible C-Type Lectin/Spleen Tyrosine Kinase Signaling Pathway Contributes to Neuroinflammation After Subarachnoid Hemorrhage in Rats[J].Stroke，2015，46(8):2277-2286.

[35] 張國威，鄒偉，劉芳，等.“百會(huì)”透“曲鬢”頭針療法對(duì)急性腦出血大鼠腦組織GDNF及VEGF表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32(9)：1264-1270.

[36] Zou W，Chen QX，Sun XW，et al.Acupuncture inhibits Notch1 and Hes1 protein expression in the basal ganglia of rats with cerebral hemorrhage[J].Neural Regen Res，2015，10(3):457-462.