高效液相色譜法同時測定飲料中6種合成著色劑

◎ 張 卉

（1.天津科技大學，天津 300457；2.天津市濱海新區(qū)漢沽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，天津 300480）

食品安全問題已經(jīng)成為社會關(guān)注的熱點，合成著色劑性質(zhì)相對穩(wěn)定、環(huán)境變化對于其影響很小、不易褪色、價格相對低廉[1]，在食品工業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用，但過量攝入存在嚴重的安全隱患，我國對合成著色劑的使用范圍和使用量有嚴格的規(guī)定[2]。因此，食品中合成著色劑的檢測顯得尤為重要。本文建立了同時檢測飲料6種合成著色劑的高效液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：日本島津LC-10ATVP高效液相色譜儀，配紫外檢測器、二極管陣列檢測器，色譜柱WondaSil C185 μm 4.6 mm×250 mm，KQ-50B超聲波清洗器，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵。

主要試劑：新紅標準溶液（1.000 mg/mL），北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司。檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍標準溶液（0.500 mg/mL），中國計量科學研究院。甲醇（色譜純），乙酸銨、檸檬酸、冰乙酸、甲酸、無水乙醇、氨水、聚酰胺粉（尼龍6），均為分析純。

1.2 試劑及標準溶液配制

①乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水溶解，于1 000 mL容量瓶中定容，用冰乙酸調(diào)pH=4，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，經(jīng)超聲波清洗器超聲排氣泡。甲醇-甲酸溶液（6+4）。無水乙醇-氨水-水溶液（7+2+1）。②合成著色劑的混合標準溶液配制：用移液器準確吸取檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍標準品各1.0 mL，以及新紅標準品0.5 mL，用pH 6的水溶解定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，配制成每毫升相當50 μg的合成著色劑。

1.3 樣品前處理

碳酸飲料：超聲驅(qū)除二氧化碳。

聚酰胺吸附法：稱取5 g（精確至0.001 g）樣品于小燒杯中，用檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH=6，將小燒杯放入水浴鍋中加熱至60 ℃，加1 g聚酰胺粉攪拌均勻成粥狀，無顆粒，用60 ℃ pH 4的水將樣品轉(zhuǎn)移至G3垂融漏斗中，然后用甲醇+甲酸（6+4）混合溶液洗滌3～5次，再用水洗至中性，用乙醇+氨水+水（7+2+1）混合溶液解吸3～5次，每次5 mL，收集解吸液于蒸發(fā)瓶中，將蒸發(fā)瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，調(diào)節(jié)蒸發(fā)溫度60 ℃，蒸發(fā)至干，用移液器準確加入5.0 mL pH 6的水定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，供高效液相色譜儀分析。

1.4 色譜條件

采用WondaSil C185 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱，紫外檢測器，乙酸銨（0.02 mol/L，pH=4）-甲醇溶液作為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。梯度洗脫程序：0～2 min甲醇從20%到50%，2～5 min甲醇從50%到100%，5～10 min甲醇保持100%，10.1～18 min甲醇保持20%。

2 結(jié)果與分析

2.1 變波長檢測程序優(yōu)化

大多數(shù)物質(zhì)在波長254 nm條件下都有較好的吸收能力，因此樣品中的雜質(zhì)峰通常會影響對組分的判斷，而可變波長檢測能使我們需要的物質(zhì)在其最大吸收波長處獲得高效色譜峰，減少雜質(zhì)組分的干擾。

通過二極管陣列檢測器全波長掃描，確定6種合成著色劑的最大吸收波長分別是：新紅508 nm、檸檬黃426 nm、莧菜紅522 nm、胭脂紅510 nm、日落黃483 nm、亮藍630 nm。

用紫外檢測器分別在6種合成著色劑的最大吸收波長λmax和定波長λ254條件下進行檢測，計算λmax/λ254的響應(yīng)比，見表1。

表1 6種合成著色劑λmax/λ254的響應(yīng)比表

通過表1可以看出，日落黃和亮藍λmax/λ254增加明顯，其他組分變化不大。由于頻繁變換波長會影響基線的穩(wěn)定性，因此可以在波長254 nm的基礎(chǔ)上，僅改變?nèi)章潼S和亮藍的檢測波長，便可以達到提高檢測靈敏度的目的。根據(jù)各組分的保留時間，設(shè)計變波長程序，即：0～ 7.6 min波長 254 nm，7.6 min波長483 nm，8.1 min波長630 nm。

以濃度為50 mg/L的合成著色劑混合標準溶液在上述條件下進樣，得到色譜圖，如圖1所示。

圖1 混合標準溶液色譜圖（濃度50 mg/L）

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

在GB5009.35-2016[2]中，樣品前處理的聚酰胺吸附法最后一步乙酸中和，由于乙酸與氨水反應(yīng)生成乙酸鹽，蒸發(fā)比較困難，無法蒸干。本文優(yōu)化該方法，去掉乙酸中和，改用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器負壓蒸發(fā)，溶液易蒸干，蒸發(fā)速度快，損失少，后用pH 6的水定容，不引入新的雜質(zhì)[3]。

2.3 標準曲線及線性范圍、檢出限

配制濃度為5、10、25、50、100 mg/L的6種合成著色劑混合標準溶液，在確定的色譜條件下進樣，橫坐標（x）為各合成著色劑的質(zhì)量濃度（mg/L），縱坐標（y）為其相對應(yīng)的峰面積，繪制標準曲線。根據(jù)3倍信噪比，計算各組分的檢出限。結(jié)果見表2。

表2 6種合成著色劑的標準曲線及檢出限、定量限表

由表2可以看出，6種合成著色劑在5～100 mg/L濃度范圍內(nèi)R2等于1或接近于1，線性關(guān)系良好，本方法的檢出限為0.17～0.70 mg/L，滿足分析要求。

2.4 加標回收率及精密度的測定

稱取5.0 g碳酸飲料，超聲去除二氧化碳，分別添加濃度為10、25、50 mg/kg的6種合成著色劑混合標準溶液，經(jīng)前處理后進行加標回收實驗，每個加標水平重復(fù)5次，計算6種合成著色劑的回收率及精密度，見表3。

表3 6種合成著色劑的回收率及精密度表（n=5）

由表3可知，6種合成著色劑的回收率在84.7%～99.2%，RSD為1.1%～2.6%，說明所建立的方法準確度好，精密度高。

3 結(jié)語

實驗表明，通過改進梯度洗脫條件、采用變波長檢測，同時優(yōu)化飲料樣品的前處理方法，采用GB 5009.35-2016中聚酰胺吸附法，將最后一步乙酸中和改為由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器負壓蒸發(fā)，后用pH 6的水定容，可以達到簡化處理過程、縮短實驗時間、提高實驗效率的目的。本文所涉及的儀器普及范圍廣，可以滿足常規(guī)分析的需求，適合于在普通實驗室中推廣使用。此方法結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，可用于飲料中6種合成著色劑（新紅、檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍）的同時測定。

[1]朱麗君.食品中合成色素和工業(yè)染料的分析方法研究與應(yīng)用[D].濟南：山東大學，2016.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 5009.35-2016食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定[S].北京：中國標準出版社，2016.

[3]郝利平.食品添加劑[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2016.