杜氏鹽藻電擊轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

宋程飛，郝敬云，程蔚蘭，史飛飛，季春麗，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)是一種光自養(yǎng)的單細(xì)胞真核綠藻，細(xì)胞沒有纖維質(zhì)細(xì)胞壁，在高鹽(NaCl濃度>30%)環(huán)境下能夠正常生長。一些鹽藻株系能高水平合成β-胡蘿卜素(>10%細(xì)胞干重)和油脂(40%～50%細(xì)胞干重)，是生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素和優(yōu)質(zhì)生物燃料的良好原料[1,2]。杜氏鹽藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、易于建立規(guī)模培養(yǎng)體系對鹽堿地進(jìn)行改良和利用。特別是鹽藻能在高鹽環(huán)境下正常生長，大規(guī)模養(yǎng)殖不易發(fā)生病蟲等污染，這使得鹽藻成為一種進(jìn)行目標(biāo)化合物生物合成途徑基因修飾的理想生物種質(zhì)材料，進(jìn)而以遺傳改造的鹽藻工程株系為平臺商業(yè)化生產(chǎn)高附加值天然產(chǎn)品[3,4]。

目前, 已有采用基因槍法[5,6]、玻璃珠法[7,8]、超聲波法[9]轉(zhuǎn)化鹽藻獲得成功的報(bào)道，這些轉(zhuǎn)化方法存在操作繁雜和成本高、轉(zhuǎn)化效率低且不穩(wěn)定等缺陷。Brown等[10]使用電擊法對微藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，不僅成本低而且操作起來簡單快捷，易于建立標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化程序。耿德貴等[11～13]和孫煜等[14]也報(bào)道了使用電擊法成功轉(zhuǎn)化杜氏鹽藻的相關(guān)內(nèi)容。迄今為止，有關(guān)鹽藻遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)多是將GUS、GFP等報(bào)告基因?qū)爰?xì)胞中。馮書營等[8]使用玻璃珠轉(zhuǎn)化法，成功地將GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入鹽藻細(xì)胞中。耿德貴等[12]使用電擊法轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)了GUS和GFP報(bào)告基因。然而，鮮有報(bào)道應(yīng)用目標(biāo)功能基因?qū)Χ攀消}藻遺傳轉(zhuǎn)化，已有的鹽藻轉(zhuǎn)化方法難以重復(fù)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系。

為此，本研究在系統(tǒng)分析杜氏鹽藻生長和發(fā)育特性的基礎(chǔ)上，以植物表達(dá)載體pCAMBIA3301為骨架，構(gòu)建高效表達(dá)來自富油植物斑鳩菊(Vernoniagalamensis)VgDGAT1a基因(編碼控制TAG合成的關(guān)鍵酶DGAT)的載體，以抗除草劑草銨膦Bar基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，對鹽藻進(jìn)行電轉(zhuǎn)化并優(yōu)化了各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)，以期獲得高效簡便的鹽藻遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步對鹽藻進(jìn)行代謝組裝，培育富集目標(biāo)化合物的優(yōu)異鹽藻工程株系和實(shí)現(xiàn)高值微藻產(chǎn)品商業(yè)化生產(chǎn)提供理論及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用藻種為杜氏鹽藻 (Dunaliellasalina)，是由本實(shí)驗(yàn)室在運(yùn)城鹽湖所取水樣中分離純化所得，命名為YC-011。所用培養(yǎng)基為DM培養(yǎng)基(表1)。用于遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體VgDGAT1a-pCAMBIA3301(圖1)載有除草劑草銨膦抗性基因Bar和外源目的基因VgDGAT1a，它編碼控制TAG合成的一個(gè)關(guān)鍵酶即DGAT1。

表1 DM培養(yǎng)基(母液)配方

注：其中A5 (Trace mental solution)的組成成分如下：H3BO32.86 g·L-1, MnCl2·4H2O 1.86 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.22 g·L-1, Na2MoO4·2H2O 0.39 g·L-1, CuSO4·5 H2O 0.08 g·L-1, Co(NO3)2·6 H2O 0.05 g·L-1。

Note: The composition of A5(Trace mental solution) is as follows: H3BO32.86 g·L-1, MnCl2·4H2O 1.86 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.22 g·L-1, Na2MoO4·2H2O 0.39 g·L-1, CuSO4·5 H2O 0.08 g·L-1, Co(NO3)2·6 H2O 0.05 g·L-1.

圖1 用于鹽藻轉(zhuǎn)化的超表達(dá)VgDGAT1a基因載體圖譜簡示Fig.1 Schematic diagram showing VgDGAT1a overexpression vector used for Dunaliella salina transformation

1.2 方法

1.2.1 杜氏鹽藻生長曲線的繪制

取生長至對數(shù)期的鹽藻培養(yǎng)液，按體積比1∶10的接種量進(jìn)行接種，在溫度(24士0.5) ℃、光強(qiáng)3 000 Lux，光暗比16 h∶8 h的條件下培養(yǎng)。每天上午9時(shí)，對培養(yǎng)液的吸光度值進(jìn)行測定，3次重復(fù)，取平均值作為當(dāng)天的測試結(jié)果。然后繪制生長曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為吸光度值。

1.2.2 鹽藻對除草劑草銨膦的敏感性試驗(yàn)

(1)液體培養(yǎng)篩選

取培養(yǎng)至第7天的鹽藻細(xì)胞，取適量草銨膦加入培養(yǎng)基中，終濃度梯度設(shè)置為0、10、20、30、40、50 mg·L-1等，每個(gè)梯度6次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.2.1。

每天上午9點(diǎn)和下午4點(diǎn)對藻細(xì)胞的形態(tài)各進(jìn)行一次觀察和記錄。培養(yǎng)至對數(shù)期時(shí)，通過稀釋平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別計(jì)算各篩選濃度下藻細(xì)胞的致死率。

(2)固體培養(yǎng)篩選

配置含草銨膦(PPT)的固體篩選培養(yǎng)基，草銨膦濃度梯度分別為0、5、10、15、20 mg·L-1。取100 μL對數(shù)期的鹽藻細(xì)胞，均勻涂布于DM固體篩選培養(yǎng)基上。每個(gè)梯度設(shè)置6組重復(fù)。培養(yǎng)條件同1.2.1，培養(yǎng)24 h后，將平板倒置。隨后每天上午9點(diǎn)和下午4點(diǎn)，各進(jìn)行一次觀察，并記錄藻落數(shù)量和生長變化。

1.2.3 鹽藻電擊轉(zhuǎn)化體系的建立及優(yōu)化

(1)試驗(yàn)材料

取培養(yǎng)至第7天的藻細(xì)胞，4 500 r·min-1離心5 min，棄上清。用新鮮培養(yǎng)基對收集的細(xì)胞沖洗一次，再次離心，收集鹽藻細(xì)胞于離心管底部。加2×HEPES[11]電擊緩沖液(HEPES 0.04 mol·L-1、NaCl 1 mol·L-1、KCl 0.01 mol·L-1、CaCl20.01 mol·L-1、甘露醇0.4 mol·L-1、山梨醇0.4 mol·L-1)調(diào)整藻液濃度至1×106個(gè)·mL-1。取400 μL藻液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，冰浴5～10 min后用于下一步電轉(zhuǎn)化。依次確定最佳脈沖時(shí)間、脈沖電壓、質(zhì)粒濃度和藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)。

(2)電擊轉(zhuǎn)化鹽藻細(xì)胞

將冰浴的質(zhì)粒和藻細(xì)胞混合液移至經(jīng)預(yù)冷處理的0.2 cm電擊杯中，參照李海東等[15]的方法，依據(jù)設(shè)置好的脈沖電壓、脈沖時(shí)間、質(zhì)粒濃度和藻細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)等梯度參數(shù)，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，每個(gè)參數(shù)分別重復(fù)6次。

(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)化的鹽藻細(xì)胞立即冰浴5 min后，從電擊杯移至1.5 mL EP管中。6 000 r·min-1離心3 min，倒掉上清液。向離心管底部細(xì)胞沉淀加1 mL 培養(yǎng)基，用移液槍反復(fù)吹打均勻。避光靜置過夜培養(yǎng)，使藻細(xì)胞恢復(fù)生長。在顯微鏡下，統(tǒng)計(jì)完整細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)(完整細(xì)胞數(shù)+破碎細(xì)胞數(shù))。兩者數(shù)目之比值即為細(xì)胞存活率。

(4)篩選陽性轉(zhuǎn)化藻細(xì)胞

常溫下，收集經(jīng)過電擊轉(zhuǎn)化的鹽藻細(xì)胞。6 000 r·min-1離心5 min后，棄上清。加入60 μL培養(yǎng)基，重懸沉淀于離心管底部的藻細(xì)胞。取重懸浮的藻細(xì)胞涂布于DM固體篩選(含20 mg·L-1草銨膦)培養(yǎng)基，并設(shè)對照。培養(yǎng)至不再有新藻落長出且藻落數(shù)基本穩(wěn)定，在第18天時(shí)，進(jìn)行單藻落計(jì)數(shù)。篩選和非篩選培養(yǎng)基上的藻落數(shù)目比值即為電擊轉(zhuǎn)化鹽藻的轉(zhuǎn)化效率/%。

(5)鹽藻細(xì)胞電擊轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

轉(zhuǎn)化過程中，設(shè)置不同的脈沖電壓、脈沖時(shí)間、藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、質(zhì)粒濃度，對轉(zhuǎn)化后細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行比較。

1.2.4 草銨膦抗性轉(zhuǎn)化藻株的分子鑒定

取1×109個(gè)杜氏鹽藻轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，用CTAB法提取基因組DNA[15]。用Trizol法提取總RNA[15]，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。分別以DNA和cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分子鑒定轉(zhuǎn)基因的整合和表達(dá)。

用于擴(kuò)增目的基因的引物序列為：

F(forward): GCTCTAGAGCCATGGCGT

TATTAGATACG

R (reverse): TCCCCCGGGGGATTATTTGC TTTTCCCCTTTT

VgDGAT1a基因的PCR反應(yīng)程序：

擴(kuò)增完成后，進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制鹽藻生長曲線

每天在同一時(shí)間點(diǎn)取杜氏鹽藻培養(yǎng)液，在最佳波長下進(jìn)行吸光度的測定，設(shè)置3組平行重復(fù)。在繪制生長曲線時(shí)，以培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)、OD684值作為縱坐標(biāo)，如圖2所示。可見，鹽藻細(xì)胞生長呈“S”型，生長至第7天時(shí)，鹽藻細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期。

圖2 杜氏鹽藻的生長曲線Fig.2 The growth curve of Dunaliella salina

2.2 篩選陽性轉(zhuǎn)化子的最適草銨膦濃度

2.2.1 液體培養(yǎng)篩選所用草銨膦濃度的確定

液體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)藻細(xì)胞至對數(shù)期時(shí)，各篩選濃度下藻細(xì)胞的致死率如表2?？梢?，隨著草銨膦濃度的增加，細(xì)胞死亡率增大；至40 mg·L-1時(shí)細(xì)胞致死率為100%。

表2不同劑量草銨膦液體培養(yǎng)中鹽藻在第7天的死亡率

Table 2 The lethal rate ofDunaliellasalinaon day 7 in the liquid medium with different dose of glufosinate-ammonium

濃度/mg·L-1Concentration死亡率/%Lethalrate00e1016.2±0.022d2037.9±0.035c3072.6±0.045b40100a50100a

注: 表中小寫字母表示處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

Note: small letters indicate that the differences between treatments are significant atP<0.05.

由圖3可見，低濃度草銨膦(10 mg·L-1)就造成部分藻細(xì)胞解體，細(xì)胞內(nèi)容物流出，藻細(xì)胞完全致死的草銨膦濃度為40 mg·L-1。因此，液體培養(yǎng)基中的篩選濃度選擇40 mg·L-1。

2.2.2 固體培養(yǎng)篩選所用草銨膦濃度的確定

固體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)藻細(xì)胞，各篩選濃度下藻細(xì)胞長出的時(shí)間及其生長狀態(tài)和數(shù)量如表3。

由表3可見，生長至第4天時(shí)，對照組有嫩綠色藻落長出，長勢良好，在培養(yǎng)基表面成片生長。草銨膦濃度為5 mg·L-1的培養(yǎng)基，與對照組相比，藻落長出的時(shí)間推遲5 d，藻落顏色嫩綠，生長密集。10 mg·L-1草銨膦的培養(yǎng)基，第13天時(shí)藻落才長出，顏色淺，數(shù)量少，均為單藻落，說明10 mg·L-1草銨膦對藻細(xì)胞有一定的抑制作用。15 mg·L-1草銨膦篩選培養(yǎng)基，到30 d時(shí)，僅有幾個(gè)單藻落，說明此濃度草銨膦顯著抑制了鹽藻細(xì)胞的生長。20 mg·L-1草銨膦篩選培養(yǎng)基，沒有藻落長出(圖4)，藻細(xì)胞生長完全被抑制。因此，實(shí)驗(yàn)確定以20 mg·L-1草銨膦濃度作為在固體培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)基因鹽藻的濃度。

圖3 不同濃度草銨膦對鹽藻存活的影響Fig.3 Effects of different concentration of glufosinate-ammonium on Dunaliella salina survival

Table3 The tolerance ofDunaliellasalinato glufosinate-ammonium in solid medium

濃度/mg·L-1Concentration藻落長出所需時(shí)間/dTimeneededforalgaespotformation生長狀態(tài)與藻落數(shù)量Growthstatusandcellnumber04細(xì)胞鮮綠色,藻落密集成片59細(xì)胞顏色嫩綠,藻落密集成片1013細(xì)胞顏色變淺綠,藻落數(shù)較對照組減少,均是單藻落1530藻落顏色發(fā)黃,藻落數(shù)極少20--

圖4 不同濃度草銨膦對鹽藻生長的影響Fig.4 Effects of different doses of glufosinate-ammonium on Dunaliella salina growth

由圖3和圖4可知，液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因鹽藻的篩選濃度為40 mg·L-1；而固體培養(yǎng)基中的篩選濃度為20 mg·L-1。造成這種差異的原因可能是：一般情況下，與液體培養(yǎng)條件下的藻細(xì)胞相比，固體培養(yǎng)條件下的藻細(xì)胞生長速度慢，生長勢弱。因此，固體培養(yǎng)所用篩選基的篩選濃度比液體的篩選濃度低。而且，液體篩選時(shí)，藻液與培養(yǎng)基的接觸面積相對于固體篩選更大，所以致死濃度相對更高一些。

2.3 電擊法各轉(zhuǎn)化參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 電擊參數(shù)對細(xì)胞存活率的影響

脈沖電壓和脈沖時(shí)間對細(xì)胞存活率的影響如圖5，即脈沖電壓一定時(shí)，細(xì)胞存活率隨著脈沖時(shí)間的增長而下降；脈沖時(shí)間一定時(shí)，細(xì)胞存活率同樣隨著脈沖電壓增大而減小。

圖5 脈沖電壓和脈沖時(shí)間對杜氏鹽藻細(xì)胞存活率的影響Fig.5 The effect of pulse voltage and time on cell survival rate of Dunaliella salina

2.3.2 電擊參數(shù)對細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

篩選和非篩選培養(yǎng)基上的藻落數(shù)目比值為鹽藻的轉(zhuǎn)化效率(‰)。由圖6得，脈沖電壓和脈沖時(shí)間分別為0.4 kV和4 ms時(shí)，篩選和非篩選培養(yǎng)基上的藻落數(shù)目比值最高，即轉(zhuǎn)化效率最高。

圖6 脈沖電壓和脈沖時(shí)間對杜氏鹽藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.6 The effect of pulse voltage and time on cell conversion efficiency of Dunaliella salina

2.3.3 藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

取培養(yǎng)天數(shù)不同、生長良好的鹽藻細(xì)胞即不同藻齡的細(xì)胞進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。由表4可見，在電擊參數(shù)相同的情況下，隨著藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加轉(zhuǎn)化效率先升后降。其中，培養(yǎng)7 d的鹽藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率最高，為1.98±0.01‰。培養(yǎng)7 d的藻細(xì)胞，正處于對數(shù)生長期，分裂旺盛，容易吸附外源基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率高[16]。

表4藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

Table 4 Effects of different cell culture time on transformation efficiency ofDunaliellasalina

藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間/dculturetime脈沖電壓/kVpulsevoltage脈沖時(shí)間/mspulsetime轉(zhuǎn)化效率/‰transformationefficiency10.440e30.440.02±0.01d50.440.83±0.02c70.441.98±0.01a90.441.04±0.03b

注:表中小寫字母表示處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

Note: small letters indicate that the differences between treatments are significant atP<0.05.

2.3.4 質(zhì)粒濃度對鹽藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

圖7顯示，在最佳脈沖電壓和脈沖時(shí)間下，鹽藻電擊轉(zhuǎn)化效率表現(xiàn)為隨著質(zhì)粒濃度的增加先增后降，當(dāng)質(zhì)粒濃度6 mg·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，約為2.63‰。

經(jīng)上述各項(xiàng)檢測，確立了杜氏鹽藻電轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化體系。脈沖電壓和脈沖時(shí)間分別為：0.4 kV、4 ms；質(zhì)粒濃度6 mg·L-1，培養(yǎng)7 d的鹽藻細(xì)胞為受體。鹽藻轉(zhuǎn)化效率高達(dá)2.63‰。

2.4 草銨膦抗性轉(zhuǎn)化株的分子鑒定

從固體篩選平板上隨機(jī)挑取4株單藻落，將其在液體篩選培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，分別提取基因組DNA、總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA[16]。根據(jù)VgDGAT1a基因的上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果(圖8、9)顯示，分別以轉(zhuǎn)基因鹽藻的DNA和cDNA為模板，PCR擴(kuò)增片段與陽性對照大小一致(1 584 bp)。將PCR擴(kuò)增片段送到生物公司測序。測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物序列與VgDGAT1a基因序列(登陸號：EF653276)完全一致，說明鹽藻VgDGAT1a基因遺傳轉(zhuǎn)化成功，并且表達(dá)正確。

圖8 轉(zhuǎn)基因鹽藻VgDGAT1a DNA分子鑒定Fig.8 DNA identification of VgDGAT1a in transgenic Dunaliella salina 注：M：DNA Marker為DL2000，泳道1～4為4株轉(zhuǎn)基因鹽藻的DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道5為陽性對照Note: M: DNA lader 2000; lane 1～4: PCR product of transgenic Dunaliella salina; lane 5: positive control

圖9 轉(zhuǎn)基因鹽藻VgDGAT1a mRNA分子鑒定Fig.9 mRNA identification of VgDGAT1a in transgenic Dunaliella salina 注：M: Marker為DL2000；泳道1～4為轉(zhuǎn)基因藻株的反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道5為陰性對照Note: M: DNAlader 2000; lane 1～4: PCR product of transgenic Dunaliella salina, lane 5: negative control

3 討論與結(jié)論

近幾年來，藻類基因工程研究以及應(yīng)用微藻規(guī)模化生產(chǎn)高值天然化合物研發(fā)日益廣為關(guān)注。一些特色經(jīng)濟(jì)藻類具有規(guī)?；囵B(yǎng)簡便、生長周期短、光合效率高和遺傳背景較高等植物簡單等特點(diǎn)，是進(jìn)行基因修飾良好的生物種質(zhì)，可通過代謝組裝培育能高效合成積累高值化合物的生物反應(yīng)器[17,18]?；谇叭擞嘘P(guān)鹽藻遺傳轉(zhuǎn)化的研究[19,20]，本文對杜氏鹽藻電轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了高效的電擊遺傳轉(zhuǎn)化體系。與其他轉(zhuǎn)化研究應(yīng)用抗生素篩選轉(zhuǎn)化藻細(xì)胞不同，本文應(yīng)用抗除草劑草銨膦基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，在培養(yǎng)基中加入20 mg·L-1草銨膦，就可殺死非轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞，獲得陽性轉(zhuǎn)化藻細(xì)胞速度快、效率高。

除使用表達(dá)載體和篩選標(biāo)記外，其他影響鹽藻轉(zhuǎn)化效率因素包括受體藻細(xì)胞生長狀態(tài)及預(yù)處理、載有目的基因的質(zhì)粒濃度、脈沖電壓、脈沖時(shí)間、緩沖液成分及用量，以及電擊后藻細(xì)胞處理等[20,21]。本研究對這些參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率顯著提高(圖5)。Shimogawara等[19,22]以萊茵衣藻為轉(zhuǎn)基因受體，對電轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率提高到2×105個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA。以鈍頂螺旋藻為受體藻種，王高歌等[23]利用電擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，亦獲得較高轉(zhuǎn)化效率(電擊導(dǎo)致細(xì)胞成活率為40%～60%)。本文通過調(diào)節(jié)電擊參數(shù)(脈沖電壓0.4 kV、脈沖時(shí)間4 ms)控制受體細(xì)胞存活率處于50%～70%區(qū)間，獲得較高的轉(zhuǎn)化率。本文建立的優(yōu)化鹽藻電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)，以培養(yǎng)7 d處于對數(shù)生長期的鹽藻為受體，應(yīng)用6 mg·L-1載體質(zhì)粒濃度，在0.4 kV電壓、脈沖時(shí)間為4 ms條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，獲得2.63‰的轉(zhuǎn)化效率，比現(xiàn)有方法轉(zhuǎn)化率提高了1.14倍。

本研究利用建立的優(yōu)化電擊轉(zhuǎn)化方法，首次將含有目的基因VgDGAT1a的植物真核表達(dá)載體VgDGAT1a-pCAMBIA3301轉(zhuǎn)化進(jìn)入杜氏鹽藻細(xì)胞并且成功表達(dá)。關(guān)于轉(zhuǎn)VgDGAT1a基因鹽藻的油脂含量提高量、表型分析及其作用機(jī)理，我們將另作報(bào)道。本研究顯示，廣泛用于高等植物的表達(dá)載體pCAMBIA3301和除草劑抗性基因Bar同樣可以用于杜氏鹽藻等微藻的遺傳轉(zhuǎn)化。源于高等植物的基因和表達(dá)載體DNA元件的應(yīng)用， 將擴(kuò)寬微藻遺傳轉(zhuǎn)化所需的DNA元件和目的基因來源。這極有利于應(yīng)用基于基因修飾的代謝工程技術(shù)對鹽藻等微藻進(jìn)行目標(biāo)代謝途徑組裝，以定向培育高效生產(chǎn)高值目標(biāo)化合物工程微藻優(yōu)異株系。本文成功將控制TAG合成的關(guān)鍵酶基因DGAT1導(dǎo)入鹽藻，有望提高鹽藻細(xì)胞油脂積累量。未來進(jìn)一步對鹽藻細(xì)胞脂肪酸合成和TAG積累途徑進(jìn)行精細(xì)組裝，創(chuàng)育出光合效率高且富集優(yōu)質(zhì)油脂的鹽藻新種質(zhì)。這樣的工程鹽藻藻種可應(yīng)用鹽堿化水體進(jìn)行規(guī)模化養(yǎng)殖，進(jìn)而商業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物燃油。這將促進(jìn)鹽堿地資源化高值利用新途徑的創(chuàng)立和綠色生物能源產(chǎn)業(yè)鏈的拓展。

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