三種內(nèi)阿米巴原蟲巢式多重PCR檢測方法

， ， ， ， ， ， ， 文超*

(1.安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.六安市動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 六安 237000)

溶組織內(nèi)阿米巴(E.histolytica) 又稱痢疾阿米巴，是目前唯一已確定具有致病性的內(nèi)阿米巴原蟲，全世界約有5 000萬人感染，每年導(dǎo)致10萬人死亡，其死亡率在原蟲寄生蟲病患者中僅次于瘧疾[1-4]。迪斯帕內(nèi)阿米巴(E.dispar)是與溶組織內(nèi)阿米巴形態(tài)相同，生活史相似的另一蟲種。全世界約有5億人感染內(nèi)阿米巴，其中很大一部分為迪斯帕內(nèi)阿米巴。莫氏內(nèi)阿米巴(E.moshkovskii)為一種非致病性的內(nèi)阿米巴原蟲，但經(jīng)常出現(xiàn)在人、鼠、非人靈長類等動物的糞便中。

從形態(tài)上看，E.histolytica的包囊或裂殖子階段與寄生于人或非人靈長類腸道的非致病性E.dispar和E.moshkovskii難以區(qū)分，因此傳統(tǒng)的鏡檢方法難以區(qū)分不同的阿米巴原蟲蟲種[5]。盡管可通過糞便培養(yǎng)后利用同工酶分析區(qū)分E.dispar和E.histolytica，但該方法周期較長，且對試驗(yàn)設(shè)備的要求較高，難以普及應(yīng)用[6]。因此，目前主要通過分子診斷方法對阿米巴原蟲進(jìn)行種類鑒定和基因分型，常用的靶基因有HLY6基因、16SrDNA、30-kDa蛋白基因等，其中16SrDNA基因已成為區(qū)分阿米巴原蟲蟲種的重要靶基因[7-8]。鑒于國內(nèi)目前有關(guān)溶組織內(nèi)阿米巴、迪斯帕內(nèi)阿米巴和莫氏內(nèi)阿米巴的分子檢測方法報(bào)道較少，本試驗(yàn)根據(jù)3種內(nèi)阿米巴原蟲16SrDNA基因序列，建立一種能夠檢測上述3種內(nèi)阿米巴原蟲的巢式PCR方法，為其分子檢測和防控提供簡便可靠的技術(shù)工具。

1 材料與方法

1.1 蟲體及基因組DNA

E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii包囊和滋養(yǎng)體均由實(shí)驗(yàn)室收集、保存，其中3種內(nèi)阿米巴原蟲包囊分離自單獨(dú)感染上述阿米巴原蟲的食蟹猴糞便(經(jīng)鏡檢和3種阿米巴原蟲特異的PCR方法鑒定[4])；3種內(nèi)阿米巴原蟲滋養(yǎng)體收集于上述糞便經(jīng)培養(yǎng)后的帶菌培養(yǎng)物。含有E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii16SrDNA片段的重組質(zhì)粒為自制，并以檢測符合要求，保存。100份食蟹猴糞便樣品采集于實(shí)驗(yàn)動物猴場。

1.2 主要試劑

rTaq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTPs和DNA MarkerDL2000均購于Takara公司；糞便DNA提取試劑盒天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品(批號：DP328-02)。

1.3 主要儀器

PCR儀(Tgradient)購于德國Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+)購于美國Bio-Rad公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Que等的方法，根據(jù)E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的16SrDNA基因設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[8]。

1.5 巢式多重PCR反應(yīng)

兩輪PCR反應(yīng)體系均為5 U/μL rTaq酶0.2 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，20 mol/L上、下游引物各0.25 μL，模板1 μL，加雙蒸水至25 μL，其中第2輪PCR時(shí)用1 μL首輪PCR產(chǎn)物作為模板。巢式PCR首輪反應(yīng)條件為96 ℃ 2 min、92 ℃ 60 s、56 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s、共30個循環(huán)；72 ℃，7 min。三種阿米巴原蟲的第二輪PCR反應(yīng)條件相同，均為96 ℃ 2 min、92 ℃ 60 s、48 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s、共30個循環(huán)、72 ℃ 7 min；分別用含E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的人糞便DNA提取物作為相應(yīng)的陽性對照。取10 μL PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照。

1.6 特異性試驗(yàn)

分別把濃度相同的E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii重組陽性質(zhì)粒DNA按同樣稀釋倍數(shù)單獨(dú)、兩兩混合或三種混合后作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以評價(jià)該P(yáng)CR方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

1.7.1 巢式多重PCR檢測阿米巴滋養(yǎng)體下限的確定 將E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的滋養(yǎng)體用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，然后分別將含106個E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii滋養(yǎng)體的溶液(各100 μL)混合后用PBS進(jìn)行稀釋。將上述稀釋后的滋養(yǎng)體溶液分別加入到20 mg的無任何阿米巴原蟲感染的食蟹猴糞便中，提取其基因組DNA后進(jìn)行巢式多重PCR檢測。

1.7.2E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii混合感染條件下巢式多重PCR檢測阿米巴滋養(yǎng)體下限的確定 3種阿米巴原蟲，分別固定其中2種阿米巴原蟲滋養(yǎng)體數(shù)量(1 000個滋養(yǎng)體)，對另外1種阿米巴原蟲滋養(yǎng)體數(shù)量進(jìn)行10倍系列稀釋(范圍從0.001～1 000個滋養(yǎng)體)，從每個稀釋液中各取1 μL作為首輪PCR模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。

1.8 糞便樣本的檢側(cè)

采集自國內(nèi)某實(shí)驗(yàn)動物猴場的100份食蟹猴糞便樣品，經(jīng)提取糞便基因組DNA后，分別用單獨(dú)檢測E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的單一PCR和巢式多重PCR進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證巢式多重PCR方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)

由圖1可知，巢式多重PCR能夠分別獲同時(shí)擴(kuò)增出3種不同的阿米巴原蟲特異條帶，E.histolytica、E.dispar、E.moshkovskii的特異條帶大小分別為439、174、553 bp，條帶大小區(qū)分明顯。

2.2 敏感性試驗(yàn)

圖1 E. histolytica、E. dispar和E. moshkovskii糞便樣本的巢式多重PCR檢測

注：M：DL2000 DNA Marker；1：E.histolytica單一擴(kuò)增；2：E.dispar單一擴(kuò)增；3：E.moshkovskii單一擴(kuò)增；4：E.histolytica和E.dispar雙重?cái)U(kuò)增；5：E.histolytica和E.moshkovskii雙重?cái)U(kuò)增；6：E.dispar和E.moshkovskii雙重?cái)U(kuò)增；7：E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii多重?cái)U(kuò)增。

2.2.1 巢式多重PCR檢測阿米巴滋養(yǎng)體下限 由圖2可知該方法可檢測至1 000個滋養(yǎng)體/0.2 g糞便，因所用模板量為1 μL，而提取的基因組DNA溶解體積為50 μL，因此所建立的巢式多重PCR方法最少可檢測到大約20個上述阿米巴原蟲滋養(yǎng)體。

圖2 巢式多重PCR敏感性試驗(yàn)

2.2.2E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii混合感染條件下巢式多重PCR檢測阿米巴滋養(yǎng)體下限的確定 1 000個E.dispar和E.moshkovskii滋養(yǎng)體作為背景的情況下，巢式多重PCR方法可檢測到最低0.01個E.histolytica滋養(yǎng)體(圖3A)，類似地，分別用1 000個其它另外兩種阿米巴原蟲滋養(yǎng)體作為背景的情況下，巢式多重PCR方法可檢測到最低1個E.dispar(圖3B)和0.1個E.moshkovskii滋養(yǎng)體(圖3C)。

圖3混合感染情況下分別檢測E.histolytica(A)、E.dispar(B)和E.moshkovskii(C)的最小滋養(yǎng)體數(shù)量
Fig.3 Detection ofE.histolytica(A),E.dispar(B) andE.moshkovskii(C) in mixed cell lysates
注：M：DL2000 DNA Marker；1～7為分別加入1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001個其它兩種阿米巴原蟲滋養(yǎng)體。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

用分別檢測E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的單一PCR方法對100份食蟹猴糞便樣品進(jìn)行檢測，共檢測出20份E.histolytica陽性，11份E.dispar陽性和1份E.moshkovskii陽性的樣本，巢式多重PCR方法共檢測出18份E.histolytica陽性，11份E.dispar陽性和1份E.moshkovskii陽性的樣本，除2份E.histolytica樣本巢式多重PCR方法未檢出陽性外，其余樣本用巢式多重PCR方法均檢出陽性。

3 結(jié)論與討論

有多種內(nèi)阿米巴屬原蟲寄生于人和動物的腸道內(nèi)，包括E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii、波列基內(nèi)阿米巴(E.polecki)、結(jié)腸內(nèi)阿米巴(E.coli)、哈氏內(nèi)阿米巴(E.hartmanni)、恰氏內(nèi)阿米巴(E.chattoni)等[1]。盡管從形態(tài)學(xué)上可以將部分內(nèi)阿米巴蟲種進(jìn)行區(qū)分，但在實(shí)際中僅根據(jù)形態(tài)進(jìn)行內(nèi)阿米巴蟲種鑒定難度較大，尤其是難以將E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii進(jìn)行區(qū)分，以前的流行病學(xué)報(bào)道可能在一定程度上因檢測方法的缺陷而高估了E.histolytica的感染率，這非常不利于疾病的診斷及防治，因此開發(fā)一種新的方便、快捷、敏感性高的檢測方法準(zhǔn)確鑒定和區(qū)分上述三種內(nèi)阿米巴原蟲勢在必行。

本研究建立了能同時(shí)檢測E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的巢式多重PCR方法。對PCR檢測方法而言，特異性和敏感性是評價(jià)其優(yōu)良與否的關(guān)鍵指標(biāo)，兩者缺一不可[9]。特異性試驗(yàn)中靶基因的選擇至關(guān)重要，因16SrDNA基因在不同內(nèi)阿米巴蟲種之間存在穩(wěn)定的遺傳偏差，且該基因在基因組上具有多拷貝性而使得該基因比單拷貝基因更易檢測，因此本試驗(yàn)中選擇16SrDNA基因作為靶基因[10]。本研究中特異性試驗(yàn)顯示E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii均擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶大小分別為439、174和553 bp，3個目的條帶能夠明顯區(qū)分，表明所建立的巢式多重PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。敏感性試驗(yàn)顯示該方法可檢測混合感染糞便樣品中阿米巴原蟲滋養(yǎng)體的最小值約為20個，在固定其它兩種內(nèi)阿米巴原蟲滋養(yǎng)體細(xì)胞數(shù)量的條件下，該方法能分別檢測到最低0.01個E.histolytica、1個E.dispar和0.1個E.moshkovskii滋養(yǎng)體，顯示該方法具有較高的敏感性。驗(yàn)證性試驗(yàn)也顯示巢式多重PCR方法與單一PCR具有較高的一致性，可應(yīng)用于臨床糞便樣本中3種內(nèi)阿米巴原蟲的檢測。