大黃素對(duì)海人酸致癇小鼠海馬iNOS和COX—2表達(dá)的影響

歐陽(yáng)龍強(qiáng)+夏文燕+楊少春+鄒連生+婁建云+高志強(qiáng)

[摘要]目的 探討大黃素對(duì)海人酸誘導(dǎo)的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬組織誘導(dǎo)型一氧化合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達(dá)的影響。方法 選取45只ICR雄性小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、癲癇持續(xù)狀態(tài)組、大黃素治療組，每組15只。采用海人酸建立小鼠癲癇模型，大黃素治療組腹腔注射200 mg/kg的大黃素。癲癇持續(xù)狀態(tài)組和對(duì)照組注入等量的生理鹽水。致癇24 h后通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色觀(guān)察海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，采用RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)iNOS、COX-2 mRNA與蛋白的表達(dá)。結(jié)果 大黃素可明顯改善癲癇鼠海馬組織的病理形態(tài)學(xué)變化；大黃素治療組iNOS、COX-2 mRNA與蛋白的含量明顯低于癲癇持續(xù)狀態(tài)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 大黃素能降低小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬組織iNOS、COX-2 mRNA與蛋白的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]大黃素；癲癇；iNOS；COX-2

[中圖分類(lèi)號(hào)] R742.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）1（b）-0011-04

[Abstract]Objective To investigate Emodin′s influence on the expression of iNOS，COX-2 in hippocampus of mice after status epilepticus by kainic acid.Methods 45 ICR male mice were selected and randomly divided into the control group，the SE group and the Emodin group，15 cases in each group.The epileptic model of mice was established by kainic acid.The treatment group was injected with 200 mg/kg by Emodin.The SE group and the control group were injected an equal amount of saline.HE stain was observed the morphological changes in hippocampal nerve after 24 h，RT-PCR and Western blot was used to detect the expression of the mRNA and protein level of iNOS，COX-2.Results Emodin could significantly relieve the hippocampal injury after status epilepticus in mice.The content of iNOS，COX-2 mRNA and protein in the Emodin group was significantly lower than that of the mRNA and protein in the SE group，with significant difference （P<0.05）.Conclusion Emodin may derease the expressions of the mRNA and protein 1evel of iNOS，COX-2 in hippocampus after status epilepticus in mice.

[Key words]Emodin；Epilepsy；iNOS；COX-2

癲癇是神經(jīng)科的常見(jiàn)疾病之一，發(fā)作形式多樣，具有很高的發(fā)病率和致殘率。癲癇發(fā)作可激活神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等釋放大量氧自由基和炎癥因子，從而造成腦組織的再次損傷[1]。iNOS和COX-2是神經(jīng)炎癥的重要介質(zhì)，在缺血、缺氧等損傷因素的作用下，參與腦組織早期炎癥反應(yīng)，并對(duì)神經(jīng)興奮性的增高起到重要作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用海人酸建立癲癇模型，探討大黃素對(duì)小鼠癲癇發(fā)作后海馬組織中iNOS、COX-2表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料

海人酸（批號(hào)：K0250）與大黃素（批號(hào)：E7881）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗鼠iNOS、COX-2多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；RT-PCR試劑盒來(lái)源于Promega公司；蛋白濃度試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供；ICR健康雄性小鼠45只[許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]，體重為23～28 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件：常溫，濕度（55±）5%，亮暗周期為12/12 h，自由飲水和進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2動(dòng)物模型建立及給藥

將45只ICR小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）組、大黃素治療組、對(duì)照組，每組15只。采用海人酸（腹腔內(nèi)注入、12 mg/kg）建立SE模型。按Racines[4]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)癲癇行為，具體如下。0級(jí)：正常行為；Ⅰ級(jí)：面部肌肉痙攣表現(xiàn)為咀嚼運(yùn)動(dòng)、眨眼、動(dòng)須等，濕狗樣顫動(dòng)；Ⅱ級(jí)：頸部肌肉痙攣表現(xiàn)為點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：站立伴雙前肢陣攣；Ⅴ級(jí)：在Ⅳ級(jí)的基礎(chǔ)上身體向后倒下失去平衡，四肢抽動(dòng)。達(dá)到Ⅲ級(jí)改變以上者定為癲癇發(fā)作，連續(xù)的癇性發(fā)作>30 min者為癲癇持續(xù)狀態(tài)。模型制備成功后，大黃素治療組立即腹腔注射大黃素200 mg/kg 1次。對(duì)照組、SE組在相同時(shí)間給予相應(yīng)體積的生理鹽水。

1.3標(biāo)本制備

每組取5只ICR小鼠，麻醉后心臟灌注40%甲醛后取腦，浸泡24 h。通過(guò)石蠟包埋切片，用于HE染色；每組另取10只ICR小鼠，麻醉后斷頭取雙側(cè)海馬，分別提取總蛋白與RNA，用于Western blot與RT-PCR的檢測(cè)。endprint

1.4 HE染色

石蠟切片4 μm，常規(guī)脫蠟脫水行HE染色，觀(guān)察海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.5 RT-PCR檢測(cè)iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)

β-actin引物序列（198bp）：5′-ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAGA-3′（上游），5′-TGC CAC AGG ATT CCA TAC CCAA-3′（下游）。iNOS引物序列（314bp）：5′-CTG CAG CAC TTG GAT CAG GAA CCTG-3′（上游），5′-GGG AGT AGC CTG TGT GCA CCT GGAA-3′（下游）。COX-2引物序列（374bp）：5′-CCA TGT CAA AAC CGT GGT GAATG-3′（上游），5′-ATG GGA GTT GGG CAG TCA TCAG-3′（下游）。用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。熱循環(huán)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，退火（iNOS：56℃ 40 s；COX-2：64℃ 40 s），72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)。凝膠掃描分析儀掃描凝膠，并分析iNOS、COX-2與β-actin基因譜帶的積分光密度，以?xún)烧弑戎担聪鄬?duì)系數(shù)）表示mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Western blot檢測(cè)iNOS和COX-2蛋白表達(dá)

勻漿后提取總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白40 μg凝膠上電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，TTBS洗3次，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。封閉后分別加入iNOS和COX-2一抗抗體，4℃靜置過(guò)夜，洗膜3次，室溫下HRP標(biāo)記二抗孵育1 h，洗膜3次。ECL顯影劑顯影，以激光掃描儀進(jìn)行定量掃描。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差和Bonferroni檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀(guān)察

各組進(jìn)行藥物干預(yù)后，SE組持續(xù)出現(xiàn)頭面部肌肉抽搐、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、凝視、雙前肢強(qiáng)直，雙前肢離地后肢站立，尾巴強(qiáng)直、轉(zhuǎn)圈、尖叫、四肢及全身強(qiáng)直，最后跌倒無(wú)法爬起，反射消失等。4 h后癥狀逐漸減輕，6～24 h仍有部分小鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作。發(fā)作級(jí)別多為Ⅳ～Ⅴ級(jí)，且發(fā)作次數(shù)頻繁。大黃素治療組發(fā)作級(jí)別多為Ⅲ級(jí)以下，且發(fā)作頻率減少。對(duì)照組未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。

2.2 HE染色

對(duì)照組海馬CA1、CA3區(qū)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)與結(jié)構(gòu)正常，著色均勻。SE組細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，排列紊亂，核固縮深染、核仁消失、細(xì)胞排列稀疏，有的神經(jīng)元腫脹，呈梭形或三角形，細(xì)胞與周?chē)纸绮磺?。大黃素治療組可見(jiàn)少量神經(jīng)元腫脹、核固縮深染等現(xiàn)象，較SE組有顯著改善（圖1）。

2.3 iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)

對(duì)各組條帶進(jìn)行光密度分析，對(duì)照組僅有少量的iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)；而SE組iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)明顯增多（P<0.01）。與SE組相比，大黃素治療后可降低iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2、表1）。

2.4 iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)

對(duì)照組中iNOS、COX-2蛋白的表達(dá)量均較少，SE組中iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)量顯著增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SE組相比，大黃素治療組可顯著降低iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)量（P<0.05）（圖3、表2）。

3討論

炎癥反應(yīng)是癲癇的重要損傷機(jī)制之一，癲癇發(fā)作后可激活大量氧自由基和炎癥介質(zhì)的釋放。炎性反應(yīng)可增加神經(jīng)元興奮性、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞壞死與凋亡[5-6]。在高炎癥因子和高興奮性的病理情況下，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可引起軸突出芽、異常突觸形成、苔蘚纖維出芽及海馬硬化，最終導(dǎo)致或加重癲癇形成惡性循環(huán)[7]。iNOS和COX-2是神經(jīng)炎癥的重要介質(zhì)，對(duì)癲癇發(fā)作后的炎性損傷及腦水腫的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，抑制兩者的合成，可以通過(guò)阻斷NO的神經(jīng)毒性、減輕血-腦脊液屏障的破壞及腦血管內(nèi)皮的損傷而明顯減輕腦組織的炎性損傷[8]。研究顯示，癲癇發(fā)作后動(dòng)物海馬區(qū)域迅速蓄積大量COX-2。COX-2在癲癇中的作用主要通過(guò)降低癲癇發(fā)作的閾值，參與癲癇發(fā)作的炎癥反應(yīng)，并可通過(guò)P糖蛋白調(diào)控血-腦脊液屏障對(duì)藥物的作用[9]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠在敲除COX-2基因后或應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑后，都可減少癲癇發(fā)作后炎癥因子的釋放[10]。本研究結(jié)果顯示，癲癇發(fā)作后COX-2的表達(dá)量明顯增多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

一氧化合酶（NOS）有三種類(lèi)型，包括神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮型（eNOS）及誘導(dǎo)型（iNOS），前兩種主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和血小板，iNOS主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞[11]。iNOS可在內(nèi)毒素、脂多糖等外界因素的刺激下被激活，活化后的iNOS可生成大量的NO，而高濃度的NO對(duì)細(xì)胞有毒性作用[12]。研究顯示，小鼠癲癇發(fā)作后iNOS mRNA的表達(dá)量顯著增多，經(jīng)藥物干預(yù)后，iNOS含量明顯減少，從而減少癲癇持續(xù)狀態(tài)后對(duì)腦組織的損傷[13]。

大黃素是中藥大黃的主要有效單體，具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗病毒、改善微循環(huán)等作用[14-16]。最近文獻(xiàn)報(bào)道，大黃素可減輕大鼠癲癇發(fā)作后的腦水腫，升高SOD、Na+-K+-ATP酶活性，降低MAD水平，具有腦保護(hù)作用[17]。Yang等[18]用海人酸建立大鼠顳葉癲癇模型，經(jīng)腹腔注入大黃素后，大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別降低，腦電圖提示棘波、尖波等癲癇波發(fā)放減少。本研究基于上述研究基礎(chǔ)，采用海人酸誘導(dǎo)小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，制模成功后，用大黃素進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果顯示，癲癇發(fā)作后小鼠海馬內(nèi)iNOS和COX-2 mRNA及蛋白的含量明顯增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。大黃素治療后能顯著減少海馬組織中iNOS、COX-2的表達(dá)，從而減少癲癇持續(xù)狀態(tài)后對(duì)腦組織的再次損傷，具有腦保護(hù)作用。其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。endprint

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（收稿日期：2017-08-10 本文編輯：祁海文）endprint