秀麗高原鰍胚胎發(fā)育觀察

梁 祥，鐘文武，冷 云，李光華，張 宇，左鵬翔，王志飛，張建斌，繆祥軍，崔麗莉，姜志武

( 1.云南省漁業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650111； 2.云南華電魯?shù)乩娪邢薰荆颇?昆明 650228 )

秀麗高原鰍(Triplophysavenusta)屬硬骨魚綱、鯉形目、鰍科、高原鰍屬魚類，僅分布于云南省漾弓江流域干支流及附屬湖泊水域(屬金沙江水系)[1]，分布地域狹窄，其野生種群抵御自然和人類影響能力較弱。近年來自然干旱少雨導(dǎo)致有秀麗高原鰍分布的龍?zhí)端蛩患眲∠陆?，自然棲息地的環(huán)境變化劇烈；由于其獨(dú)特的口感及風(fēng)味，深受產(chǎn)地人們的喜愛，對野生種群的捕撈屢禁不止；而隨著產(chǎn)地旅游經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，對秀麗高原鰍的消費(fèi)需求也急速增長，對自然種群的存續(xù)構(gòu)成嚴(yán)重挑戰(zhàn)，亟需開展物種保護(hù)相關(guān)工作。目前，秀麗高原鰍的有關(guān)研究僅有生物學(xué)性狀與肌肉氨基酸組成[2]和肌肉營養(yǎng)成分與品質(zhì)[3]野外棲息地水質(zhì)狀況[4]、野生群體種群生存力與最小可存活種群數(shù)估算[5]及其野生群體的時空分布區(qū)域[6]等研究；掌握人工繁殖及胚胎發(fā)育的時空條件是進(jìn)行人工保護(hù)的重要條件，高原鰍屬魚類胚胎發(fā)育的研究目前僅見于安氏高原鰍(T.angeli)[7]、西昌高原鰍(T.xichangensis)[8]、貝氏高原鰍(T.bleekeri)[9]和葉爾羌高原鰍[T.(Hedinichthys)yarkandensis][10]。對秀麗高原鰍開展人工繁殖技術(shù)研究，在一定環(huán)境中，觀察胚胎發(fā)育進(jìn)程，為其人工擴(kuò)繁提供技術(shù)保障，有益于物種保護(hù)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

網(wǎng)箱(1 m×1 m×1 m),篩絹(40 cm×40 cm)，不銹鋼圓口盆，購自寧波第二激素廠的促黃體素釋放激素類似物和人絨毛膜促性腺激素，1 mL醫(yī)用注射器，sartorius BSA224S-CW分析天平， Nikon SMZ800體視鏡，Nikon ECLIPSE50i正置顯微鏡，75%醫(yī)用酒精，鑷子，直尺等。

1.2 試驗(yàn)親本

2015年7月29日，于云南省鶴慶縣草海鎮(zhèn)新華村黑龍?zhí)毒偷赜玫鼗\現(xiàn)場捕撈秀麗高原鰍親本，雄魚體長4.9～7.4 cm，體質(zhì)量2.0～6.4 g；雌魚體長6.5～10.0 cm，體質(zhì)量3.6～16.4 g。雌雄性比1∶1，親本合計200尾。雌體腹部明顯膨大，彈性較好，色彩艷麗有光澤，體型較短；雄體較細(xì)長，體色較暗。

1.3 試驗(yàn)方法

2015年7月29日8:00，對所有采集的親魚采用人工背部肌肉一次注射催產(chǎn)素(促黃體素釋放激素類似物5 μg/kg+人絨毛膜促性腺激素1000 IU/kg)，雌魚0.2 mL，雄魚減半，注射后將其置于龍?zhí)兜木W(wǎng)箱中，網(wǎng)箱中放有篩絹，每2 h觀察一次，待其產(chǎn)卵授精后，收集附有魚卵的篩絹置于室內(nèi)的不銹鋼盆中，計數(shù)并進(jìn)行人工孵化，孵化過程中，每日早晚各換一次水，新水來自黑龍?zhí)?，水溫差控制在?.0 ℃以內(nèi)，于體視鏡下觀察受精卵的發(fā)育情況，每次觀察卵粒數(shù)不少于30粒，拍照并記錄發(fā)育周期，用NIS-Elements軟件測定數(shù)據(jù)。出膜后，移出篩絹，待平游后以雞蛋黃做開口餌料，進(jìn)行仔魚的人工培育。所得數(shù)據(jù)用Excel 2007處理。

2 結(jié)果與分析

通過活體解剖，卵粒成熟至Ⅴ期時，卵徑為1.03 mm；卵具有黏性；在水溫17.0 ℃條件下，人工催產(chǎn)后約24 h產(chǎn)卵，計數(shù)獲卵1517粒，并置于室內(nèi)盆中孵化，孵化水溫(17.5±1.0) ℃，經(jīng)約77.75 h，開始出膜，剛出膜時仔魚全長3.66 mm，卵黃經(jīng)約120 h吸收后，開始平游覓食。

2.1 胚胎發(fā)育觀察

秀麗高原鰍的胚胎發(fā)育全程可劃分為7個階段：受精卵胚盤形成階段、卵裂階段、囊胚階段、原腸胚階段、神經(jīng)胚形成階段、器官形成階段和孵化出膜階段。胚胎發(fā)育各時期特征見表1。

表1 秀麗高原鰍胚胎發(fā)育時序

(續(xù)表1)

發(fā)育時期記錄時間間隔時間/min外部特征圖序眼囊出現(xiàn)期2015?07?318：30324眼囊形態(tài)清晰，呈橢圓形，頭部可分辨出原始的前、中、后三部分，整個胚體卵徑達(dá)到1．33mm。1s尾芽形成期2015?07?3113：40310胚體末端腹面與卵黃球結(jié)合部出現(xiàn)尾基形態(tài)。1t尾芽出現(xiàn)期2015?07?3114：4868胚體末端腹面與卵黃球結(jié)合部，呈圓錐狀。1u尾芽游離期2015?07?3115：4153胚體末端腹面圓錐狀與卵黃分球離。1v晶體出現(xiàn)期2015?07?3116：2544眼囊中出現(xiàn)橢圓的晶狀體。1w肌肉效應(yīng)期2015?07?3118：20115胚胎出現(xiàn)微弱斷續(xù)的收縮，由背部肌節(jié)向尾部傳遞。1x心跳期2015?07?3119：1050位于眼囊下方與卵黃球之間的心臟開始微弱搏動，約20次/min。1y耳囊出現(xiàn)期2015?08?0112：001010外觀形態(tài)呈橢圓形，較明亮的空腔，位于腦后方。1z耳石出現(xiàn)期2015?08?0118：00360位于耳囊中，耳石形態(tài)清晰可辨，體視鏡下呈透亮心形狀。1a1出膜前期2015?08?0212：201100胚胎在膜內(nèi)劇烈翻滾，卵黃球占據(jù)膜內(nèi)大部分空間，呈淡黃色，眼球分布黑色素細(xì)胞，體側(cè)集聚不規(guī)則黑褐色斑狀，心跳達(dá)到120次/min。1b1出膜期2015?08?0217：10290尾部先破膜而出，軀體不斷掙扎破膜。1c1剛出膜的仔魚2015?08?0217：2313出膜的仔魚側(cè)臥水底，全長3．66mm。1d1平游的仔魚2015?08?0716：407157口裂形成，卵黃球消失，鰾充氣，尾鰭開始角質(zhì)化，能平游覓食。1e1成熟卵細(xì)胞2015?07?299：30—視野中外觀形態(tài)呈圓形，充滿卵黃，卵徑為1．03mm。1f1

2.2 胚胎各階段發(fā)育歷時

因采用半人工繁殖，受精卵胚盤形成階段推測歷時為約1 h，卵裂階段歷時4.50 h、囊胚階段歷時3.08 h、原腸胚階段歷時1.58 h、神經(jīng)胚形成階段歷時3.43 h、器官形成階段歷時64.07 h和孵化出膜階段歷時0.22 h。在水溫(17.5±1.0) ℃條件下，秀麗高原鰍約77.75 h孵化出膜(表1)。

2.3 胚胎心跳變化

首次記錄胚胎心跳為20次/min，由受精卵至記錄第一次心跳歷時約34.42 h(表1)。

自20次/min記錄始，胚胎心跳無規(guī)律，16.62 h后，心跳達(dá)到82次/min，隨著器官發(fā)育的持續(xù)，心跳達(dá)到100次/min，剛出膜的仔魚心跳達(dá)到120次/min(圖2)。

3 討 論

3.1 秀麗高原鰍人繁關(guān)鍵條件與適應(yīng)性

秀麗高原鰍野生群體分布于海拔2190 m的鶴慶盆地伴山龍?zhí)?龍?zhí)端磥碜园樯接咳?[11]，夜間常匐于敞水區(qū)底部的水草之間，秀麗高原鰍與鰍科大部分種類一樣，體型小[12]，開展人工繁殖時，與泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)類似[13]，選擇半人工方式，避免人工擠卵造成親魚大量死亡。通過注射催產(chǎn)素(促黃體素釋放激素類似物、人絨毛膜促性腺激素)進(jìn)行人工繁殖，獲得受精卵，表明與“四大家魚”一樣[14]，在高原鰍屬魚類中，可通過注射外源性激素對其繁殖進(jìn)行人工干預(yù)，為秀麗高原鰍野生種群的人為補(bǔ)充提供了可能。在水溫17.0 ℃條件下，秀麗高原鰍催產(chǎn)效應(yīng)時間約24 h，較泥鰍在23.0 ℃條件下，效應(yīng)時間13 h要長[15]。該研究中，受精卵黏于篩絹上，胚胎孵化期間，卵粒未脫落，表明秀麗高原鰍屬黏性卵，與安氏高原鰍微黏性、貝氏高原鰍、葉爾羌高原鰍卵的特性一致[7,9-10]。同時，秀麗高原鰍卵的特性表明與環(huán)境的適應(yīng)，自然產(chǎn)卵繁殖時，受精卵能黏于龍?zhí)端萆献匀环趸?/p>

圖2 秀麗高原鰍胚胎心跳變化

圖1 秀麗高原鰍胚胎發(fā)育a.受精卵；b.胚盤隆起；c.2細(xì)胞期；d.4細(xì)胞期；e.16細(xì)胞期；f.32細(xì)胞期；g.64細(xì)胞期；h.多細(xì)胞期；i.囊胚早期；j.囊胚中期；k.囊胚晚期；l.原腸早期；m.原腸中期；n.原腸晚期；o.神經(jīng)胚期；p.胚孔封閉期；q.體節(jié)出現(xiàn)期r.眼基出現(xiàn)；s.眼囊出現(xiàn)期；t.尾芽形成；u.尾芽出現(xiàn)期；v.尾芽游離期；w.晶體出現(xiàn)期；x.肌肉效應(yīng)期；y.心跳期；z.耳囊出現(xiàn)期；a1.耳石出現(xiàn)期；b1.出膜前期；c1.出膜；d1.剛出膜的仔魚；e1.平游的仔魚；f1.成熟卵細(xì)胞.

3.2 胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因子影響

魚類胚胎發(fā)育具有各自物種的特異性，主要受遺傳因素影響，同時，在發(fā)育過程中，也受水溫、溶氧、光照等外因的影響[16]，在(17.5±1.0) ℃條件下，秀麗高原鰍孵化時間約77.75 h，西昌高原鰍在(22.0±0.5) ℃條件下，孵化時間93 h；安氏高原鰍在水溫(16.3～18.1) ℃時，孵化時間119.73 h，貝氏高原鰍在9.0～12.8 ℃條件下，孵化時間287 h，葉爾羌高原鰍在(20.0±1.0) ℃條件下，歷時65.57 h孵化出膜。在已報道的高原鰍屬魚類中，秀麗高原鰍與葉爾羌高原鰍胚胎發(fā)育時間較接近；但在水溫條件基本一致時，秀麗高原鰍的胚胎發(fā)育時間遠(yuǎn)小于安氏高原鰍[7-10]。

3.3 胚胎發(fā)育過程中卵黃的形態(tài)與吸收

秀麗高原鰍胚胎發(fā)育階段與細(xì)鱗裂腹魚(Schizothoraxchongi)[17]、鱸鯉(Percocyprispingi)[18]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[19]等大部分硬骨魚類似，可分為7個階段，在時序上因外環(huán)境的因素，呈現(xiàn)提早或推遲現(xiàn)象。隨著器官的形成，圓球形的卵黃囊逐漸變?yōu)槌瞿r的長橢圓狀，在(17.5±1.0) ℃條件下，120 h后，卵黃消耗完畢，開始平游覓食，卵黃的吸收時間與，貝氏高原鰍仔魚在水溫4.0～15.0 ℃條件下，經(jīng)192 h吸收完[9]，光唇裂腹魚(S.lissolabiatus)仔魚在水溫15.0～17.0 ℃條件下，卵黃經(jīng)216 h吸收完[20]，葉爾羌高原鰍仔魚在(20.0±1.0) ℃條件下，卵黃經(jīng)96～120 h吸收完，開始攝食[10]。同屬魚類中，適溫條件下，卵黃的吸收時間與水溫呈負(fù)相關(guān)，即水溫越低，卵黃消耗時間越長，與魚類生長周期中溫度對代謝速率的影響基本一致[21]，不同屬的魚類中消耗時間與卵黃體積的關(guān)系還需進(jìn)一步研究，不同物種的野外生境以及遺傳特性，表現(xiàn)出不同的繁殖策略及胚胎發(fā)育過程。

3.4 心跳特征比較

秀麗高原鰍第一次心跳約為授精后34.42 h，為20次/min，至剛出膜時120次/min。安氏高原鰍授精后52.5 h，心臟開始搏動，心跳起始為3～11次/min，至53 h后心跳約55次/min[7]；貝氏高原鰍授精后168.8h心臟開始搏動，心跳為10次/min，授精后186.3,心跳為29次/分，至授精后248.5 h心跳為53次/min[9]；葉爾羌高原鰍約為授精后48 h出現(xiàn)心臟搏動[10]。胚胎發(fā)育過程中心臟搏動同屬各物種呈無規(guī)律狀，推測心跳變化的差別具有物種先天的特征和自身的屬性。

通過對秀麗高原鰍人工繁殖條件的探索和受精卵收集和孵化技術(shù)的研究，為實(shí)現(xiàn)秀麗高原鰍人工增殖放流奠定了基礎(chǔ)條件，以期有效減緩自然種群的捕撈壓力和應(yīng)對水域環(huán)境劇烈變化。秀麗高原鰍仔魚平游覓食后，開口餌料以及培育技術(shù)仍需做進(jìn)一步的研究。

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