不同脫礦程度牙本質(zhì)的拉曼光譜研究

薛麗麗+閆冰+杜歐+蘇若為+曾曉華+蔡巧玲

[摘要] 目的 研究不同脫礦程度牙本質(zhì)的拉曼光譜特征，為臨床應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)檢測牙本質(zhì)脫礦情況提供理論基礎(chǔ)。方法 方便收集2016年1—5月間廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔門診拔除的下頜智齒10顆，經(jīng)過打磨去除表面牙釉質(zhì)，制備牙本質(zhì)組織標(biāo)本，經(jīng)過不同濃度EDTA溶液和不同時(shí)間脫礦處理后，分別檢測其拉曼光譜，比較不同脫礦程度牙本質(zhì)拉曼光譜間的差異，并以差異譜峰的對應(yīng)波數(shù)繪制拉曼光譜圖像。同時(shí)應(yīng)用能譜儀檢測不同脫礦程度牙本質(zhì)表面的元素含量，驗(yàn)證拉曼光譜結(jié)果。結(jié)果 該研究共獲得不同脫礦程度牙本質(zhì)特征拉曼光譜共80例。通過比較研究發(fā)現(xiàn)，隨著牙本質(zhì)脫礦程度的增加，拉曼光譜中代表磷酸根的960 cm-1波數(shù)處譜峰強(qiáng)度逐漸降低，表示牙本質(zhì)表面磷酸鈣鹽減少，而代表C-H鍵的2 950 cm-1波數(shù)處譜峰強(qiáng)度逐漸增高，表示牙本質(zhì)表面有機(jī)組織增加。能譜儀元素分析結(jié)果也提示隨著脫礦程度的增加，牙本質(zhì)表面鈣、磷元素的濃度逐漸降低。結(jié)論 不同脫礦程度牙本質(zhì)組織中磷酸鈣鹽含量降低，有機(jī)組織增加，拉曼光譜可以檢測不同脫礦程度牙本質(zhì)組織成分變化，特別是以2 950 cm-1波數(shù)處光譜強(qiáng)度值兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），可以用于鑒別不同脫鈣程度的牙本質(zhì)，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。

[關(guān)鍵詞] 牙本質(zhì)；脫礦；拉曼光譜；鑒別

[中圖分類號(hào)] R783 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）12（c）-0022-05

[Abstract] Objective This paper tries to study the Raman spectra of dentin with different degree of demineralization， to provide a theoretical basis for the clinical application of Raman spectroscopy in detecting dentin demineralization. Methods 10 mandibular wisdom teeth extracted from the oral clinics of this hospital from January to May in 2016 were convenient collected. After grinding and removing the enamel， the dentin tissue specimens were prepared. After different concentrations of EDTA solution and demineralization treatment， the Raman spectra of the dentin samples were compared and their Raman spectra were compared. The Raman spectra were compared with the corresponding wavenumber of the different peaks. At the same time， the content of element on the surface of dentin with different degree of demineralization was detected by energy spectrometer， and the result of Raman spectroscopy was verified. Results In this study， a total of 80 cases of different characteristics of demineralization of dentin Raman spectra were obtained. Through the comparative study， with the increase of dentin demineralization， the peak intensity of the 960 cm-1 wavenumber representative of phosphate radical in Raman spectrum gradually decreases， indicating that the calcium phosphate salt on the surface of dentin decreases while the 2 950 cm-1 wave number at the peak intensity gradually increased， indicating that the dentine surface organic tissue increases. The results of elemental analysis also indicated that the concentration of calcium and phosphorus decreased gradually with the increase of demineralization. Conclusion The content of calcium phosphate in dentine tissue with different degree of demineralization is decreased and the organic structure is increased. Raman spectroscopy could detect the change of dentin tissue composition with different degree of demineralization. Especially， the spectral intensity at 2 950 cm-1 was compared with each other for The difference was statistically significant（P<0.05）， which can be used to identify the degree of decalcification of dentin， has good potential for clinical application.endprint

[Key words] Dentin； Demineralization； Raman spectroscopy； Identification

臨床上牙體缺損修復(fù)主要采用樹脂、玻璃離子、金屬冠及全瓷冠等材料，這些材料與牙體組織通過不同的粘結(jié)材料來實(shí)現(xiàn)固位[1]。現(xiàn)有的粘結(jié)體系是通過酸蝕牙本質(zhì)，在牙本質(zhì)表層形成脫礦層，暴露牙本質(zhì)表層的膠原纖維和牙本質(zhì)小管，改變牙本質(zhì)表面性狀，使得粘結(jié)材料可以滲入牙本質(zhì)脫礦后的膠原纖維網(wǎng)架和牙本質(zhì)小管中，形成混合層或樹脂突來獲得微機(jī)械固位力[2]。隨著對牙本質(zhì)表面形態(tài)及粘結(jié)系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的逐漸深入，改善牙本質(zhì)表面性能的表面處理成為提高粘結(jié)性能的關(guān)鍵[1]。牙本質(zhì)表面采用不同的磨削處理，可以形成不同厚度、密度及其他性質(zhì)的玷污層，因此不同的牙本質(zhì)表面處理，會(huì)對牙本質(zhì)與自酸蝕粘結(jié)劑之間的粘結(jié)強(qiáng)度產(chǎn)生一定的影響[3]。目前，臨床應(yīng)用的粘結(jié)體系主要應(yīng)用酸蝕劑對牙本質(zhì)表面進(jìn)行脫礦處理，但尚無針對個(gè)體化牙體組織的設(shè)計(jì)，如硬化性牙本質(zhì)所需的粘結(jié)時(shí)間可能較普通牙本質(zhì)長，且臨床上尚無技術(shù)或方法能夠檢測和鑒定不同粘結(jié)材料對不同牙本質(zhì)表面處理程度。拉曼光譜技術(shù)是基于拉曼散射效應(yīng)的振動(dòng)光譜技術(shù)，通過激發(fā)光與散射光波長的變化來反應(yīng)樣本分子結(jié)構(gòu)的改變或組成成分的變化，目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，如腫瘤組織的鑒別診斷、體液分析、硬組織成分研究等[4-6]。拉曼光譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是對測試組織無損傷，無需特別處理，且快速準(zhǔn)確，是一種具有實(shí)時(shí)、快速、無創(chuàng)、準(zhǔn)確的檢測新方法，特別適用于樣本的表面性狀研究[7]。因此，該研究擬采用拉曼光譜技術(shù)對不同脫礦程度的牙本質(zhì)表面進(jìn)行研究，比較不同脫礦程度的牙本質(zhì)表面光譜差異，以期為臨床上應(yīng)用拉曼光譜檢測牙本質(zhì)酸蝕程度提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科拔除的下頜智齒10顆作為牙本質(zhì)組織樣本。患者年齡為25～28歲之間，性別比約為1∶1。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者無牙體硬組織疾患，無全身系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：牙本質(zhì)過敏或牙周炎患者?；颊咝g(shù)前均簽署了知情同意書，該研究獲得廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。將收集的離體磨牙經(jīng)過去除表面纖維結(jié)締組織、75%酒精浸泡消毒后，采用TR-26型號(hào)（藍(lán)標(biāo)）車針去除牙體組織表面釉質(zhì)，TR-13F型號(hào)（紅標(biāo)）車針打磨，TR-26EF型號(hào)（黃標(biāo)）車針拋光。再依次使用目數(shù)800、1 500、2 000的砂紙對表面進(jìn)行拋光，去除牙本質(zhì)表面雜質(zhì)。然后將牙體組織制備成約5 mm×5 mm組織塊備用。

1.2 牙本質(zhì)的脫礦處理

該研究共收集下頜智齒10顆，每顆智齒共制備2個(gè)牙本質(zhì)組織樣本，共20個(gè)牙本質(zhì)樣本。首先將未脫礦處理的牙本質(zhì)樣本直接進(jìn)行拉曼光譜檢測，獲得特征光譜。之后將牙本質(zhì)樣本依次經(jīng)過濃度10%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min、15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min以及15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡30 min后分別進(jìn)行拉曼光譜檢測，獲得不同脫鈣程度的牙本質(zhì)拉曼光譜。

1.3 拉曼光譜檢測

將制備好的牙本質(zhì)標(biāo)本放置在顯微拉曼光譜儀Nanophoton Raman-11載物臺(tái)，參數(shù)設(shè)定為785 nm激光為激發(fā)光，功率為600 mW，每個(gè)牙體組織樣本檢測區(qū)域面積設(shè)定為160 μm×80 μm，掃描時(shí)間為20 s，平均累加2次取平均值為該樣本的拉曼光譜。光譜波數(shù)記錄范圍為400～4 500 cm-1，分辨率為2 cm-1。同時(shí)采用Raman Imager軟件以光譜波數(shù)2 950 cm-1和960 cm-1繪制牙本質(zhì)的拉曼光譜圖像與顯微鏡下圖像進(jìn)行比較分析。

1.4 能譜儀分析牙本質(zhì)表面成分

將不同脫礦程度的牙本質(zhì)組織樣本依次通過Quanta-250型X射線能譜儀EDS 進(jìn)行牙本質(zhì)組織樣本表面成分分析，選取牙本質(zhì)表面中心區(qū)域進(jìn)行鈣、磷、碳、氧、鎂等元素成分分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用LABSPEC 2.0軟件去除牙本質(zhì)組織拉曼光譜的熒光背景、消除噪音信號(hào)并對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理。應(yīng)用Origin 8.0軟件對處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，會(huì)診光譜圖像，同時(shí)通過歸一化處理以光譜波數(shù)2 950 cm-1和960 cm-1平均光譜強(qiáng)度繪制柱形圖，比較不同脫礦程度牙本質(zhì)的譜峰強(qiáng)度。同時(shí)對960 cm-1和2 950 cm-1兩個(gè)波數(shù)處光譜強(qiáng)度進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

該研究共獲得未脫礦處理的牙本質(zhì)組織特征拉曼光譜20例，不同脫礦程度的牙本質(zhì)組織特征拉曼光譜60例，共80例。通過平均光譜比較可以看出，在450～4 500 cm-1波段區(qū)域內(nèi)，牙本質(zhì)組織主要表現(xiàn)為960 cm-1與2 950 cm-1兩個(gè)波數(shù)譜峰明顯增強(qiáng)，其中960 cm-1表示磷酸根特征譜峰，與牙本質(zhì)硬組織磷酸鈣鹽成分相關(guān)。而2 950 cm-1表示為C-H鍵特征譜峰，與牙本質(zhì)硬組織中有機(jī)成分相關(guān)（圖1）。比較不同脫礦程度的牙本質(zhì)組織特征拉曼光譜可以發(fā)現(xiàn)，隨著脫礦程度的逐漸增加，960 cm-1波數(shù)處的拉曼光譜譜峰強(qiáng)度逐漸降低，表示牙本質(zhì)表面的磷酸鈣鹽成分逐漸減少，而2 950 cm-1波數(shù)處的拉曼光譜譜峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表示牙本質(zhì)表面的有機(jī)組織成分逐漸增加（圖2）。通過歸一化處理的960 cm-1與2 950 cm-1波數(shù)處的柱狀圖同樣提示，隨著脫鈣程度的不斷增加，牙本質(zhì)表面的磷酸鈣鹽成分逐漸減少，而牙本質(zhì)表面的有機(jī)組織成分逐漸增加。分別以960 cm-1與2 950 cm-1波數(shù)處光譜強(qiáng)度兩兩間進(jìn)行比較，其中960 cm-1波數(shù)處光譜兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而2 950 cm-1波數(shù)處光譜兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

通過Raman Imager軟件分別以960 cm-1和2 950 cm-1波數(shù)的拉曼光譜強(qiáng)度繪制拉曼圖像，與顯微鏡下圖像相比，960 cm-1波數(shù)處譜峰表示磷酸鹽的含量，圖像呈現(xiàn)模糊不清，無法表現(xiàn)牙本質(zhì)表明情況。而以2 950 cm-1波數(shù)處譜峰繪制的拉曼圖像，表示了有機(jī)組織的含量，與顯微鏡下圖像相比，可以清洗的表現(xiàn)牙本質(zhì)小孔的結(jié)構(gòu)，與顯微鏡圖像相近，同時(shí)隨著脫礦程度的不斷增加，其拉曼圖像表現(xiàn)的牙本質(zhì)表面小孔的密度越來越高（圖3）。endprint

通過能譜儀對不同脫礦程度牙本質(zhì)組織表面進(jìn)行元素分析，未脫礦組牙本質(zhì)組織表面鈣和磷的平均相對原子濃度為11.6%和7.6%，而經(jīng)過濃度10%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min后牙本質(zhì)組織表面鈣和磷的平均相對原子濃度為9.5%和6.1%，而再次經(jīng)過15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡15 min脫礦后的牙本質(zhì)組織表面鈣和磷的相對原子濃度下降到了9.0%和6.0%，而后經(jīng)過15%EDTA溶液超聲震蕩浸泡30 min脫礦處理后的牙本質(zhì)組織表面，其鈣和磷的相對原子濃度則降至7.6%和5.2%。不同脫礦程度的牙本質(zhì)能譜分析中鈣磷相對原子濃度的下降與脫礦程度呈正相關(guān)（圖4），與拉曼光譜檢測結(jié)果相一致。

3 討論

在臨床進(jìn)行牙體缺損修復(fù)時(shí)，修復(fù)體脫落的情況時(shí)有發(fā)生，主要原因是粘接劑的粘接效果不佳所導(dǎo)致，這與粘接劑的選擇、修復(fù)體表面的處理以及牙本質(zhì)表面處理等因素相關(guān)[1]。目前，臨床使用的粘接系統(tǒng)，不論是自酸蝕粘接系統(tǒng)還是全酸蝕粘接系統(tǒng)，均采用酸蝕處理牙本質(zhì)表面，在臨床使用過程中，醫(yī)生按照說明進(jìn)行操作，但對不同性質(zhì)的牙本質(zhì)組織沒有個(gè)性化的酸蝕處理，均采用單一的操作步驟和酸蝕處理時(shí)間，這就導(dǎo)致了不同牙本質(zhì)表面的酸蝕效果不同，從而影響了后期粘接效果[8]。因此，隨著今年來的研究，對牙本質(zhì)表面形態(tài)及粘接系統(tǒng)不斷深入的了解，國內(nèi)學(xué)者將改善牙本質(zhì)表面性能作為提高粘接性能的研究重點(diǎn)[9-10]。但是在臨床酸蝕過程中，醫(yī)生無法依靠復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室儀器來實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確地判斷不同礦化程度牙本質(zhì)表面酸蝕處理的情況，因此，提供一種快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測牙本質(zhì)酸蝕程度的方法可以幫助臨床醫(yī)生更好地判斷牙本質(zhì)酸蝕情況，提高修復(fù)體與牙本質(zhì)粘接性能。

拉曼效應(yīng)是由印度科學(xué)家Raman于1928年發(fā)現(xiàn)[11]，并因此而獲得諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。其主要原理是根據(jù)分子及分子團(tuán)對入射激光產(chǎn)生非彈性散射形成的光譜（即拉曼光譜）來分析分子及分子團(tuán)的結(jié)構(gòu)，分子鍵能之間的變化及特定分子的含量等，被譽(yù)為“分子指紋”[12]。近年來隨著激光技術(shù)及儀器的不斷發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究，特別是對疾病鑒別診斷、生物樣該組織無創(chuàng)檢測等研究提供了一種便捷而準(zhǔn)確的新方法[13-14]。薛麗麗等[14]應(yīng)用拉曼光譜對唇腺炎癥組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，正常唇腺組織與慢性炎癥唇腺組織的拉曼光譜存在差異，通過分析比較光譜差異，建立鑒別診斷模型，可以應(yīng)用拉曼光譜對慢性炎性唇腺組織進(jìn)行鑒別診斷，準(zhǔn)確率達(dá)到了91.8%。拉曼光譜技術(shù)不但能夠用于軟組織病變的檢測研究，同樣也適用于硬組織變化的檢測研究。Lakshmi等[14]應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)研究下頜骨放射性骨髓炎病變，發(fā)現(xiàn)960 cm-1波數(shù)處譜峰對應(yīng)骨骼中的磷酸鈣鹽成分，而2 950 cm-1波數(shù)處譜峰對應(yīng)骨骼中有機(jī)組織的C-H鍵。發(fā)現(xiàn)放射性骨髓炎組織內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞成分降低，隨著骨骼內(nèi)鈣磷成分減少， 960 cm-1波數(shù)處譜峰強(qiáng)度降低，而隨著有機(jī)成分的增加2 950 cm-11波數(shù)處譜峰強(qiáng)度增加。以上研究結(jié)果與該研究相似。目前，國內(nèi)外有關(guān)牙體硬組織的拉曼光譜研究主要集中在釉質(zhì)表面酸蝕及牙本質(zhì)齲壞結(jié)構(gòu)改變的研究，尚無關(guān)于牙本質(zhì)脫礦拉曼光譜定量研究[16-17]。Lemor等[18]在研究牙本質(zhì)化學(xué)酸蝕過程中同樣發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜中960 cm-1譜峰與牙本質(zhì)中的磷酸鈣鹽相關(guān)。該研究中，不同脫礦程度的拉曼光譜存在差異，其中960 cm-1波數(shù)處譜峰對應(yīng)磷酸根，其強(qiáng)度隨著脫礦程度的增加而降低，表明牙本質(zhì)組織脫礦后羥基磷灰石[Ca10（OH）2（OP4）6]成分減少，這與能譜儀分析牙本質(zhì)組織表面元素成分相近。而2 950 cm-1波數(shù)處譜峰對應(yīng)的是有機(jī)組織成分，其強(qiáng)度隨著脫礦程度的增加而增加，說明隨著鈣磷酸鹽的減少，有機(jī)組織成分占比逐漸升高。相關(guān)研究表面EDTA處理牙本質(zhì)表面時(shí)可以將接近牙本質(zhì)小管開口5 μm內(nèi)的鈣鹽沉積物全部或大部分溶解[10]。而通過拉曼光譜圖像對比，可以更直觀地觀察牙本質(zhì)組織表面牙本質(zhì)小孔的變化，從而了解牙本質(zhì)表面脫礦程度及酸蝕處理情況。

綜上所述，拉曼光譜可以檢測不同脫礦程度的牙本質(zhì)組織，主要表現(xiàn)為磷酸根對應(yīng)的960 cm-1處譜峰及與有機(jī)組織相關(guān)的C-H鍵對應(yīng)的2 950 cm-1處譜峰。隨著脫礦程度的變化，拉曼光譜的譜峰也隨之改變。表面拉曼光譜可以有效地檢測牙本質(zhì)表面組織的礦化程度及變化情況，可以為臨床提供一種快速、便捷、準(zhǔn)確、無創(chuàng)及原位實(shí)時(shí)檢測牙本質(zhì)組織的新方法，具有巨大的應(yīng)用潛力，但拉曼光譜譜峰強(qiáng)度變化與牙本質(zhì)脫礦程度的定量關(guān)系需要進(jìn)一步大樣本量的研究。

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（收稿日期：2017-09-23）endprint