硫酸酯化牡蠣多糖對(duì)四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的影響

趙冠華，曲敏，胡斯杰，佟長(zhǎng)青，李偉

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023)

牡蠣是全球養(yǎng)殖規(guī)模最大的貝類，也是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣資源豐富、口味宜人，并具有鎮(zhèn)靜安神、滋陰補(bǔ)陽(yáng)、軟堅(jiān)散結(jié)、收斂固澀等藥用價(jià)值功效，被稱為 “海底牛奶”[1]。多糖廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是構(gòu)成生命體的基本物質(zhì)。對(duì)多糖進(jìn)行硫酸酯化能使其產(chǎn)生更多的生物活性[2]。硫酸酯化多糖具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒[5]等生物活性。因?yàn)槎嗵潜８蔚臋C(jī)理主要是清除自由基，防止自由基對(duì)肝細(xì)胞損傷，通常具有抗氧化活性的多糖均具有保肝作用[6]。Shi等[7]利用熱水浸提法提取的牡蠣多糖，對(duì)四氯化碳 (CCl4)致小鼠急性肝損傷和酒精致小鼠慢性肝損傷具有保護(hù)作用。侯麗等[8]利用水提醇沉法提取牡蠣多糖，對(duì)小鼠急性酒精肝損傷具有保護(hù)作用，作用機(jī)理可能是提高了肝組織的抗氧化能力。目前尚未見(jiàn)對(duì)硫酸酯化牡蠣多糖保肝作用的報(bào)道。本研究中，用實(shí)驗(yàn)室前期制備得到的粗牡蠣多糖[7]除蛋白純化后，進(jìn)行硫酸酯化修飾，制備硫酸酯化牡蠣多糖 (SCGP)，研究了SCGP對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，以期為牡蠣的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

粗牡蠣多糖由本實(shí)驗(yàn)室前期制備所得；氯磺酸、吡啶、N，N-二甲基酰胺 (DMF)、硫酸鉀、三氯乙酸、氯化鋇、分子量標(biāo)準(zhǔn)品 (Dextran T-10、 Dextran T-40、 Dextran T-70、 Dextran T-500、Dextran T-2000)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SPF級(jí)昆明小鼠 (體質(zhì)量18～22 g)購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SCXK(遼)2008-0002]；聯(lián)苯雙脂滴丸 (批號(hào)160701)購(gòu)自北京協(xié)和藥廠；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶、丙二醛和考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司；其他試劑均為分析純。

試驗(yàn)用主要儀器有：L-2130型高效液相色譜儀(日本Hitachi公司)；2000ES型蒸發(fā)光檢測(cè)器(美國(guó) Alltech公司)；MuLTiSJAN MK3酶標(biāo)儀、Microcl 17R離心機(jī) (美國(guó) Thermo公司)；DMLLLED型倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；UV-754紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗牡蠣多糖的制備 參考Shi等[7]的方法。取去除內(nèi)臟的新鮮牡蠣肉，粉碎勻漿，勻漿液熱水浸提3次，過(guò)濾得上清液，上清液冷卻至室溫，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.1，等電點(diǎn)沉淀過(guò)夜，以8000 r/min離心10 min得上清液，上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量截留量為10 000的中空纖維聚砜膜得截留液，噴霧干燥得到牡蠣多糖。

1.2.2 粗牡蠣多糖除蛋白質(zhì) 粗牡蠣多糖采用Sevag法[9]除蛋白質(zhì)。將噴霧干燥后的粗牡蠣多糖配制成10%濃度的水溶液，加入Sevag試劑 (正丁醇∶三氯甲烷＝1∶5)，牡蠣多糖溶液與Sevag試劑的體積比為4∶1，振蕩充分反應(yīng)30 min，靜置后用分液漏斗分液，保留上層清液，重復(fù)5次。在上層清液中加3倍體積乙醇沉淀過(guò)夜，以8000 r/min離心10 min，收集沉淀，真空冷凍干燥得純化牡蠣多糖。

1.2.3 多糖、蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[10]，采用Follin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[11]。

1.2.4 硫酸酯化牡蠣多糖的制備 采用氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化牡蠣多糖[12]。

酯化劑的制備：向三頸燒瓶中加入60 mL吡啶，在冰水浴中充分?jǐn)嚢韬?，?0 min內(nèi)逐滴加入10 mL氯磺酸，制得酯化試劑備用。

酯化試驗(yàn)：在40 mL N，N-二甲基甲酰胺中溶解2.0 g前期純化的牡蠣多糖，充分?jǐn)嚢韬蠹尤氲窖b有酯化試劑的三頸燒瓶中，60℃下水浴，攪拌3 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉溶液調(diào)至中性。之后加入3倍體積的乙醇 (體積分?jǐn)?shù)95%)過(guò)夜，以8000 r/min離心10 min得沉淀。將沉淀溶解于水中，透析3 d，真空冷凍干燥得到硫酸酯化修飾產(chǎn)物[13]。

1.2.5 硫酸根含量及相對(duì)分子量的測(cè)定

(1)硫酸根含量。采用明膠-比濁法測(cè)定SCGP硫酸基含量[14]。稱取樣品3 mg，加入1 mL濃度為1 mol/L的鹽酸，100℃下水解6 h，冷卻后揮發(fā)干燥，殘?jiān)? mL蒸餾水溶解。用硫酸鉀溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以0.2 mL鹽酸溶液作為空白，分別加入三氯乙酸3.8 mL、氯化鋇-明膠溶液1.0 mL，室溫下靜置15 min，在360 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)1；以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇溶液，同法測(cè)定吸光值A(chǔ)2。以硫酸基毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值 (A1-A2)為縱坐標(biāo)，制作硫酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取代值(DS)＝ 162×(S/98)/(100-96×S/98)，其中，S為硫酸根含量占多糖百分比。

(2)相對(duì)分子質(zhì)量。使用液相色譜法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量，采用TSK-Gel G5000PW XL色譜柱(TOSOH)(300 mm×7.8 mm)， 流速為0.2 mL/min，用2000ES型蒸發(fā)光檢測(cè)器 (Alltec)檢測(cè)分析。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品采用Dextran T-10(10 000)、Dextran T-40(40 000)、 Dextran T-70(70 000)、Dextran T-500(500 000)和Dextran T-2000(2000 000)，標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配成1 mg/mL溶液，進(jìn)樣量為20 μL，記錄保留時(shí)間，計(jì)算洗脫體積。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，求線性回歸方程。樣品用超純水配制成1 mg/mL溶液，同條件下進(jìn)行分析，記錄保留時(shí)間，算出洗脫體積，代入回歸方法計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.6 CCl4致小鼠急性肝損傷模型的建立 將72只SPF級(jí)昆明小鼠 (雌、雄各半)分為6組，分別為對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙脂 (200 mg/kg)藥物組，以及硫酸酯化牡蠣多糖低濃度 (200 mg/kg)、中濃度 (400 mg/kg)、高濃度 (800 mg/kg)劑量組，各組每日灌胃1次，對(duì)照組和模型組給予同體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d，于末次給藥2 h后，對(duì)照組按0.2 mL/10 g腹腔注射植物油，模型組、藥物組、SCGP灌胃組均腹腔注射含0.2%CCl40.2 mL/10 g植物油溶液，禁食不禁水，18 h后摘眼球取血，離心 (3000 r/min，10 min)，取上層血清，置于冰箱 (-20℃)中凍存?zhèn)溆谩Ｌ幩佬∈蠛笱杆偃「闻K，用生理鹽水洗凈，用濾紙吸干血水，稱取肝左葉組織0.3 g，制成10%的勻漿液，離心 (4500 r/min，10 min)，取上清液，4℃下保存?zhèn)溆?。稱取肝右葉組織0.3 g，用中性福爾馬林溶液進(jìn)行固定，石蠟包埋切片。蘇木精-伊紅(H.E)染色，在倒置顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)[15]。1.2.7 生化指標(biāo)檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，以及肝組織勻漿液中超氧化物歧化酶 (SOD)活性和丙二醛 (MDA)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±S.D.)表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化后的牡蠣多糖含量及蛋白質(zhì)含量

用苯酚-硫酸法測(cè)得粗牡蠣多糖含量為57.4%，用Follin-酚法測(cè)得粗牡蠣多糖中蛋白質(zhì)含量為28.7%。其中蛋白質(zhì)含量仍然較高，故采用Sevag法脫除蛋白質(zhì)，經(jīng)Sevag法脫除蛋白質(zhì)后，測(cè)得多糖含量為97.8%，蛋白質(zhì)含量為1.8%，這表明蛋白質(zhì)脫除效果較好。

2.2 SCGP的硫酸根含量及其相對(duì)分子量

用明膠-比濁法測(cè)得SCGP的硫酸根含量為28.96%，取代值 (DS)為 0.66。如圖 1所示，SCGP純度良好、分子量組成均一。經(jīng)分子量標(biāo)準(zhǔn)品制作相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y＝-0.2441 x+8.7011(R2＝0.9973)，代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程得到SCGP的相對(duì)分子質(zhì)量聚集度大于2 000 000，表明SCGP是大分子多聚糖。

圖1 SCGP的高效液相色譜分子量鑒定Fig.1 Molecular mass identification of SCGP by HPLC

2.3 SCGP對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷生化指標(biāo)的影響

SCGP對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷生化指標(biāo)結(jié)果如表1所示，模型組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著區(qū)別于對(duì)照組(P＜0.05)，表明建模成功。模型組小鼠血清中ALT、AST活性顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)，肝組織中SOD活性顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)，肝組織中MDA含量顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。藥物組與模型組相比，所檢測(cè)指標(biāo)均有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明聯(lián)苯雙脂滴丸具有治療效果。灌胃SCGP各劑量組的小鼠血清中ALT和AST活性，肝組織中MDA含量均顯著低于模型組 (P＜0.05)，SCGP高劑量組SOD活性與模型組相比顯著上升(P＜0.05)，說(shuō)明低、中、高劑量組的SCGP均可顯著抑制由CCl4導(dǎo)致的小鼠血清ALT、AST活性的升高，并可以降低小鼠肝組織中MDA含量。灌胃SCGP高劑量組可顯著提高肝損傷小鼠肝組織中SOD活性，但低、中SCGP劑量組無(wú)顯著性差異。

2.4 SCGP對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷肝組織學(xué)的影響

肝組織切片顯示 (圖2)，正常組小鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則，模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞無(wú)規(guī)律性，并有炎癥、壞死現(xiàn)象，主要原因是CCl4致細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜損壞，組織液外流。SCGP灌胃組和藥物組肝細(xì)胞病變較模型組明顯減少，這表明SCGP能明顯減輕CCl4對(duì)肝組織的急性損傷。

表1 SCGP對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清和肝組織中酶活性的影響 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝10)Tab.1 Effects of SCGP on activities of serum and hepatic enzymes in mice with liver injury induced by CCl4(mean±S.D.，n＝10)

3 討論

CCl4經(jīng)肝臟細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝，導(dǎo)致自由基增加，影響生物結(jié)構(gòu)或通過(guò)氧激活產(chǎn)生的三線態(tài)氧，對(duì)肝臟產(chǎn)生損傷作用。CCl4致小鼠急性肝損傷模型的建立主要用來(lái)篩選和評(píng)價(jià)保肝藥物[16-17]。多糖護(hù)肝原理主要是其能有效清除自由基，減少CCl4在肝組織中產(chǎn)生的自由基，防止肝組織病變，達(dá)到對(duì)肝組織的保護(hù)目的，此類多糖有山藥硒多糖[18]、蟲(chóng)茶多糖[19]、藥桑多糖[20]、金線蓮多糖[21]等；其次，多糖能改善肝損傷小鼠的生化指標(biāo)，降低小鼠ALT、AST和MDA含量，提高SOD活性，達(dá)到減輕肝損傷的作用，原因可能是多糖提高了肝臟線粒體呼吸復(fù)合酶活性，并通過(guò)清除自由基來(lái)減少過(guò)氧化程度，恢復(fù)正常功能[22]；三是，多糖能促進(jìn)免疫細(xì)胞DNA合成，使脾細(xì)胞和T細(xì)胞大量增殖，提高機(jī)體免疫能力[23]，如西洋參多糖能顯著促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[24]。

小鼠肝損傷時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量ALT、AST，并進(jìn)入血液中，導(dǎo)致兩種轉(zhuǎn)氨酶在小鼠血清中大量升高，只要有1%的肝細(xì)胞損傷，就能使血清酶活性升高一倍，故這兩種酶是檢測(cè)肝細(xì)胞受損的靈敏指標(biāo)[25]。CCl4損傷小鼠肝細(xì)胞是其在體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，干擾蛋白質(zhì)合成，影響生物體的結(jié)構(gòu)和功能[6]。SOD是保護(hù)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的主要成分，其可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基損害，同時(shí)SOD也是衡量機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)[26]。MDA是細(xì)胞過(guò)氧化作用最終產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物，其含量可以間接表明機(jī)體組織的過(guò)氧化程度，反映肝臟細(xì)胞損傷情況[27]。本研究表明，較高濃度的SCGP對(duì)CCl4導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷具有明顯的減輕作用。

圖2 各組小鼠肝組織切片對(duì)比 (H.E，×100)Fig.2 Histopathological comparison of liver in mice invarious groups(H.E，×100)

同時(shí)，根據(jù)SCGP肝損傷生化指標(biāo)結(jié)果，對(duì)比之前Shi等[7]等研究的牡蠣多糖對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的保肝試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫酸酯化的牡蠣多糖的保肝能力得到了提升。經(jīng)過(guò)SCGP灌胃的小鼠ALT、MDA指標(biāo)可分別降低31%～74%和24%～59%，而灌胃牡蠣多糖兩指標(biāo)只能降低12%～17%和6%～11%[7]，并且灌胃SCGP后AST和SOD指標(biāo)均能恢復(fù)至接近正常水平，表明經(jīng)過(guò)硫酸酯化后牡蠣多糖的保肝能力確實(shí)得到了提升。

4 結(jié)論

本研究中用牡蠣多糖通過(guò)硫酸酯化制備得到SCGP，并用其對(duì)由CCl4致急性肝損傷小鼠進(jìn)行了灌胃試驗(yàn)，研究了SCGP對(duì)CCl4導(dǎo)致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，SCGP低、中、高劑量組可顯著降低血清中 ALT、AST活性 (P＜0.05)，明顯降低肝組織中MDA含量 (P＜0.05)，SCGP高劑量組可顯著提高肝組織中SOD活性(P＜0.05)。肝組織切片觀察，SCGP組能減輕肝細(xì)胞損傷狀況。本研究表明，SCGP能有效保護(hù)受損的肝組織，減輕CCl4對(duì)小鼠肝組織的急性損傷。

[1] 徐靜.牡蠣提取物的降血糖活性研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2005.

[2] Wang Li，Li Xiaoxuan，Chen Zhengxing.Sulfated modification of the polysaccharides obtained from defatted rice bran and their antitumor activities[J].International Journal of Biological Macromolecules，2009，44(2)：211-214.

[3] Wang Junlong，Niu Shengfan，Zhao Baotang，et al.Catalytic synthesis of sulfated polysaccharides.Ⅱ：comparative studies of solution conformation and antioxidant activities[J].Carbohydrate Polymers，2014，107(17)：221-231.

[4] Ji Chenfeng，Ji Yubin，Meng Deyou.Sulfated modification and antitumor activity of laminarin[J].Experimental and Therapeutic Medicine，2013，6(5)：1259-1264.

[5] Ghosh T，Chattopadhyay K，Marschall M，et al.Focus on antivirally active sulfated polysaccharides：from structure-activity analysis to clinical evaluation[J].Glycobiology，2009，19(1)：2-15.

[6] 曲敏，田麗冉，佟長(zhǎng)青，等.大鯢低聚糖肽對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].食品工業(yè)科技，2013，34(14)：350-352，369.

[7] Shi Xuan， Ma Huihui， Tong Changqing， et al.Hepatoprotectiveeffect of a polysaccharide from Crassostrea gigas on acute and chronic models of liver injury[J].International Journal of Biological Macromolecules，2015，78：142-148.

[8] 侯麗，汪秋寬，何云海，等.牡蠣多糖提取及其對(duì)小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用[J].食品工業(yè)科技，2014，35(22)：356-358，370.

[9] Staub A M.Removal of proteins：sevag method[M]//Whistler R L.Methods in Carbohydrate Chemistry.New York， USA：Academic Press， Inc，1965：5-6.

[10] DuBois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Chem，1956，28(3)：350-356.

[11] 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].2版.北京：高等教育出版社，1997.

[12] Strydom D J.Chromatographic separation of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone-derivatized neutral，acidic and basic aldoses[J].Journal of Chromatography A，1994，678(1)：17-23.

[13] 趙冠華，佟長(zhǎng)青，李偉，等.硫酸酯化牡蠣多糖對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制及凋亡的影響[J].食品工業(yè)科技，2017，38(13)：302-306.

[14] Yang Jingfeng，Zhu Beiwei，Zheng Jie，et al.Stimulation of lymphocyte proliferation by oyster glycogen sulfated at C-6 position[J].Carbohydrate Polymers，2013，94(1)：301-308.

[15] 郭國(guó)麗，陳悅，佟長(zhǎng)青，等.水溶性黑木耳根多糖對(duì)四氯化碳所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].食品工業(yè)科技，2015，36(24)：341-344.

[16] Kuriakose G C，Kurup M G.Antioxidant and antihepatotoxic effect of Spirulina laxissima against carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in rats[J].Food ＆ Function，2011，2(3-4)：190-196.

[17] Tomasi A，Albano E，Banni S，et al.Free-radical metabolism of carbon tetrachloride in rat liver mitochondria.A study of the mechanism of activation[J].Biochemical Journal，1987，246(2)：313-317.

[18] 滕楊，谷娜，羅時(shí)旋，等.山藥硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].食品工業(yè)科技，2015，36(15)：362-364.

[19] 王睿，孫鵬，趙欣.蟲(chóng)茶粗多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷預(yù)防效果研究[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31(5)：6-11.

[20] 夏娜，陳義磊，陶海燕，等.藥桑多糖對(duì)四氯化碳所致大鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].食品科學(xué)，2015，36(13)：247-251.

[21] Zeng Biyu，Su Minghua，Chen Qingxi，et al.Protective effect of a polysaccharide from Anoectochilus roxburghii against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice[J].Journal of Ethnopharmacology，2017，200：124-135.

[22] 耿廣琴，楊志軍，楊秀娟，等.黃芩水煎液對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝線粒體的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2015，22(6)：641-643.

[23] 高峰，趙龍鳳.干擾素聯(lián)合薄芝糖肽治療慢性乙型肝炎30例觀察[J].醫(yī)學(xué)信息，2011，24(1)：214.

[24] 楊修仕，周閑容，王麗君 ，等.西洋參多糖的超濾分離及其免疫增強(qiáng)活性研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35(5)：49-52，57.

[25] Comporti M.Lipid peroxidation and cellular damage in toxic liver injury[J].Lab Invest，1985，53(6)：599-623.

[26] 王吉橋，樊瑩瑩，徐振祥，等.飼料中β-胡蘿卜素和蝦青素添加量對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)及抗氧化能力的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(3)：215-220.

[27] 欒學(xué)斌，王荻，劉紅柏.恩諾沙星誘導(dǎo)施氏鱘藥物性肝損傷模型的建立及復(fù)方中草藥保肝作用研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，32(1)：13-19.