親和雙水相膠束系統(tǒng)的相行為及其應用

劉 耀， 周鑫鑫， 鄧 剛

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

雙水相膠束系統(tǒng)(aqueous two-phase micellar system，ATPMS)是一種生物化學領域的液液萃取技術(shù)，因其具有生物相容性好、可調(diào)節(jié)因素多、對膜蛋白增溶效果好等優(yōu)點而備受關(guān)注[1-2].在這個系統(tǒng)中，表面活性劑水溶液在一定條件下會自發(fā)分離成互不相溶的膠束富集相與膠束缺失相，利用兩相間物理化學性質(zhì)的差異，根據(jù)體積排阻效應、靜電相互作用和疏水相互作用等的不同，實現(xiàn)不同生物分子的分離[3].自1981年Bordier[4]使用表面活性劑Triton X-114(TX)構(gòu)成的雙水相系統(tǒng)，首次實現(xiàn)兩親性內(nèi)膜蛋白與親水蛋白的分離后，雙水相膠束系統(tǒng)就被成功應用于蛋白質(zhì)[5-7]、抗生素[8]和DNA[9]等多種生物分子的萃取.近年來,更多的研究集中在雙水相膠束系統(tǒng)中引入親和配基以提高萃取的回收率和特異性.如Garg等[10]在TX上偶聯(lián)色素形成一種親和表面活性劑對乳酸脫氫酶的分離；Lam等[11]利用非離子型表面活性劑C10G1與CBM9標簽間的親和作用，對帶有CBM9標簽的綠色熒光蛋白GFP進行分配；Wang等[12]初步探索由TX螯合鎳離子與TX構(gòu)成的親和雙水相膠束系統(tǒng)對富組氨酸標簽蛋白EGFP的萃取效果等.

(a)HM-EO

(b)TX-Cu(Ⅱ)

在疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)形成的一元膠束系統(tǒng)中進行實驗[13-14]，引入帶有親和配基的小分子表面活性劑Triton X-114-IDA-Cu(Ⅱ)(TX-Cu(Ⅱ))，構(gòu)建新型的親和雙水相混合膠束系統(tǒng)HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)(見圖1).考察了親和表面活性劑加入量、溫度、pH、鹽離子濃度及種類對新系統(tǒng)液液相平衡性質(zhì)的影響.并以重組蛋白3′,5′-二磷酸核苷酸酶為模型蛋白，研究新系統(tǒng)對富組氨酸蛋白的萃取選擇性效果，為其實際應用提供基礎依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)購于瑞典Akzo Nobel Surface Chemistry AB公司，分子量約為55.8 kD；Triton X-114購于上海生工生物工程有限公司；亞氨基二乙酸(IDA)購自國藥集團化學試劑有限公司；3′,5′-二磷酸核苷酸酶，實驗室參照Yang等[15]方法表達及純化.其他試劑均為市售分析純.

Cary 4000紫外分光光度計(美國安捷倫科技有限公司)；FE20型pH計(上海梅特勒-托利多有限公司)；DDS-307電導率儀(上海精密科學儀器有限公司)；BSA224S電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；DZF-6050B真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司).

1.2 TX-Cu(Ⅱ)的合成

TX-Cu(Ⅱ)合成方法見參考文獻[16].首先，以TX為載體，通過環(huán)氧氯丙烷(ECH)法進行羥基活化；然后TX-環(huán)氧化物在堿性條件下偶聯(lián)亞氨基二乙酸(IDA)，經(jīng)氯仿萃取并真空干燥處理，合成得到TX-IDA；最后將TX-IDA與銅離子螯合，經(jīng)再次萃取得到TX-Cu(Ⅱ).

1.3 雙水相相圖測定

用PBS緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)配制質(zhì)量濃度均為10%的HM-EO與TX-Cu(Ⅱ)母液.按不同配比混合兩種母液，加入適量緩沖液，配制成總質(zhì)量5 g的雙水相體系，其中HM-EO質(zhì)量分數(shù)均為2.5%，TX-Cu(Ⅱ)質(zhì)量分數(shù)分別為0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%.體系混合均勻，于10 ℃水浴中恒溫靜置24～48 h分相.測定上相與下相體積，并分別取樣測定HM-EO含量.

HM-EO濃度測定[17]：稱取一定量的待測樣品，加入等量丙酮，并用質(zhì)量比為1∶1的丙酮-水溶液稀釋.取0.5 g稀釋液，加入5 mL考馬斯亮藍G250試劑，靜置30 min，620 nm處測吸光值，由標準曲線得到HM-EO濃度.利用稱重法(真空干燥法)求得上下相中水的含量，質(zhì)量衡算得到兩相中TX-Cu(Ⅱ)含量，進而繪制相圖描述雙水相膠束系統(tǒng)的相行為.實驗重復3次，取平均值.

1.4 模型蛋白親和分配

YND用PBS緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)配制成2.5 mg/mL母液.取2 mL母液加入到不同配比的HM-EO與TX-Cu(Ⅱ)混合溶液中，配制成5 g的ATPMS，其中HM-EO質(zhì)量分數(shù)為2.5%，TX-Cu(Ⅱ)質(zhì)量分數(shù)從0.00%～0.15%變化.混合均勻，1 000 r/min離心5 min后于10 ℃水浴中恒溫靜置5 h分相.取樣分析上下相中YND的酶活以及總蛋白含量.

YND活性根據(jù)PAP水解作用中NADH的消耗測定[15].酶活力單位(U)定義為特定條件下(4 ℃，pH 8.0)，每min可以氧化1 μmol NADH所需的酶量.總蛋白濃度采用Lowry法[18]，以BSA標準品制作標準曲線.分配系數(shù)Ke表示系統(tǒng)上相與下相中酶濃度的比值；Yt與Yb分別為上下相的酶活回收率(%).

2 結(jié) 果

2.1 雙水相膠束系統(tǒng)相圖

新構(gòu)建的雙水相膠束系統(tǒng)中，HM-EO是一個嵌段共聚物，親水的聚氧乙烯鏈上帶有表面活性基團，能與合成的親和表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)形成混合膠束[13].圖2為2.5%的HM-EO與不同濃度TX-Cu(Ⅱ)形成的雙水相膠束系統(tǒng).圖2顯示，HM-EO與TX-Cu(Ⅱ)的配比顯著影響了新雙水相系統(tǒng)的成相穩(wěn)定性，隨著TX-Cu(Ⅱ)濃度的增加，兩相間的雙結(jié)線長度逐漸變短，表明體系由兩相趨于均相.TX-Cu(Ⅱ)濃度在0.0%～0.6%時，系統(tǒng)中TX-Cu(Ⅱ)主要分配在下相，與HM-EO形成帶親和配基的混合膠束；隨著TX-Cu(Ⅱ)含量的增加，下相中由高分子聚氧乙烯HM-EO形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸崩潰，相分離更加困難；在TX-Cu(Ⅱ)濃度高于1.0%以后，系統(tǒng)趨于均相，TX-Cu(Ⅱ)可能更多地以單膠束的形式存在.

圖2 HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖

2.2 溫度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖的影響

圖3顯示，隨著溫度的升高，系統(tǒng)的兩相區(qū)域(共存曲線之間的區(qū)域)逐漸變大，表明升高溫度有利于系統(tǒng)的分相.系統(tǒng)溫度升高會破壞HM-EO聚氧乙烯鏈與水分子之間的氫鍵結(jié)合，促進水分子從下相自發(fā)轉(zhuǎn)移至上相，增加聚合物在下相的濃度，從而有利于膠束之間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成[19-20].另外，分子熱運動加劇，帶親和配基的小分子表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)更易插入到HM-EO網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中形成混合膠束，對新構(gòu)建系統(tǒng)的穩(wěn)定有利.在本研究中，由于主成相劑HM-EO的分子量較大、濁點低，因此，系統(tǒng)中加入一定比例TX-Cu(Ⅱ)所構(gòu)成的HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)在較低的溫度下(4 ℃)可以穩(wěn)定快速分相[14-21]，并且上下相的水含量均超過90%，適合用于對生物活性物質(zhì)的萃取.

圖3 HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)在不同溫度下的相圖

2.3 pH對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖的影響

實驗考察pH對系統(tǒng)相圖的影響，結(jié)果如圖4所示.隨著pH值的降低，兩相區(qū)域逐漸變大，上相HM-EO膠束濃度減少，下相膠束濃度增大，表明新構(gòu)建的ATPMS在酸性環(huán)境更容易分相.表1顯示，TX-Cu(Ⅱ)在下相的含量隨著溶液pH值降低逐漸增大，HM-EO與帶親和配基的小分子表面活性劑可以形成更加穩(wěn)定的雙水相膠束系統(tǒng).由于溶液的pH會顯著影響蛋白質(zhì)分子的電性及所帶電荷數(shù)，所以可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在系統(tǒng)中的分配系數(shù)[22]。因此，選擇合適的pH對該雙水相體系用于蛋白質(zhì)的分配具有潛在的研究價值.

圖4 溶液pH對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖的影響

pHw(TX-Cu(Ⅱ))/%0.00.20.40.60.81.030.000.350.670.901.111.2350.000.320.640.871.071.2170.000.300.580.800.991.1690.000.250.450.710.901.09110.000.220.440.650.881.06

2.4 無機鹽濃度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖的影響

無機鹽雖然不是成相的必需組分，但是在應用雙水相膠束系統(tǒng)分離生物物質(zhì)時，系統(tǒng)中通常會存在一定濃度的無機鹽，鹽濃度對相平衡性質(zhì)會產(chǎn)生一定的影響.另外，鹽濃度發(fā)生微小變化即可顯著影響生物分子的分配[19]，因此，在實際應用雙水相膠束系統(tǒng)之前，需先了解無機鹽對相行為及分配行為的影響.圖5考察不同鹽濃度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相平衡的影響，結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的增大，系統(tǒng)兩相區(qū)域逐漸增大.一方面，添加鹽離子可以壓縮混合膠束擴散雙電層，膠束網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)收縮并在下相聚集.另一方面，無機鹽的加入引起反離子靜電屏蔽作用的增強[19]，膠束帶電聚集體離子頭基間的距離縮短，膠束間斥力減弱，小分子表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)更容易進入下相與HM-EO形成混合膠束(見表2).因此，通過增加鹽濃度，有利于混合膠束網(wǎng)絡的形成，促進新構(gòu)建系統(tǒng)的成相與穩(wěn)定.

圖5 NaCl濃度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖的影響

表2 NaCl濃度對不同質(zhì)量分數(shù)TX-Cu(Ⅱ)在下相含量的影響

n(NaCl)/mMw(TX-Cu(Ⅱ))/%0.00.20.40.60.81.000.000.300.580.800.991.16500.000.340.630.861.051.191000.000.340.690.891.111.301500.000.390.740.921.151.38

2.5 不同種類鹽離子對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖的影響

圖7為陽離子對系統(tǒng)相圖的影響.通過對比圖7(a)和圖7(b)常見的氯化鹽及溴化鹽，結(jié)果表明，K+在促進系統(tǒng)分相效果上略優(yōu)于Na+.一般地，陽離子加入系統(tǒng)后，能夠自發(fā)地與聚氧乙烯鏈相結(jié)合(熵增加過程)而使其“脫水”，這種去溶劑化效應有利于系統(tǒng)分相，隨著結(jié)合位點逐漸接近飽和，熵不再增加，系統(tǒng)達到相平衡.在一定濃度范圍內(nèi)，與Na+相比，K+更易與聚氧乙烯鏈結(jié)合而達到飽和，因而，添加有K+的系統(tǒng)存在較大的兩相區(qū)域[24].

圖6 不同種類陰離子對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)相圖的影響

(a)氯化鹽

(b)溴化鹽

2.6 YND在HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)中的親和分配

在模型蛋白分配實驗中，重組蛋白YND帶有六聚組氨酸標簽.圖8顯示，系統(tǒng)中不含TX-Cu(Ⅱ)時，YND主要分配于上相(Ke=1.681)，但是TX-Cu(Ⅱ)的存在可以改變YND分配行為，使其從傾向于分配到上相轉(zhuǎn)為更易分配于下相.并且，隨著TX-Cu(Ⅱ)在系統(tǒng)中含量的增加，ATPMS萃取分離的選擇性增強，Ke在TX-Cu(Ⅱ)濃度為0.150%時降至0.153%，表明TX-Cu(Ⅱ)在富組氨酸蛋白分配中具有高的親和結(jié)合效率.酶活回收代表分配過程中酶活性損失的程度.圖8還顯示，TX-Cu(Ⅱ)濃度在0.00%～0.15%時，YND酶活回收率總和下降小于2.60%，TX-Cu(Ⅱ)對酶活影響不大，這與Wang等[12]的研究結(jié)論相一致.因此，實驗構(gòu)建的HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)可以有效用于對富組氨酸蛋白YND的分離純化.

圖8 TX-Cu(Ⅱ)濃度對YND分配的影響

3 討 論

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