淳安花豬5個功能基因的多態(tài)性研究

， ，，劉平，，，*

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310024； 2.淳安縣畜牧獸醫(yī)局)

淳安縣地處浙西，峰巒起伏，澗溪縱橫，淳安花豬原產(chǎn)于浙江省淳安縣境內(nèi)的山區(qū)，在長期的民間選育過程中，逐漸形成了這一具有地方特色的優(yōu)良豬種，其肉美味鮮，同時有性情溫順、產(chǎn)仔數(shù)多、耐粗飼等特性，是我國地方豬種“基因庫”中的寶貴豬種資源。

據(jù)調(diào)查，近三十年來，淳安花豬在當(dāng)?shù)氐娘曫B(yǎng)規(guī)模銳減，岌岌可危[1-4]。畜禽地方品種資源危機是當(dāng)代全球性生物危機的重要組成部分。畜禽地方品種資源一旦遭到破壞，也就意味著歷經(jīng)億萬年進化和積累的許多優(yōu)良基因的永遠丟失。雖然我們還無法充分預(yù)測未來如何利用這些地方品種資源，但是擁有豐富的品種資源，人類就能夠經(jīng)受更大的挑戰(zhàn)，獲得更大的生存空間。畜禽地方品種資源是維持人類生存、維護生態(tài)安全和實現(xiàn)經(jīng)濟與社會可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略性資源。因此，對淳安花豬遺傳特性展開深入研究具有重要的現(xiàn)實意義。本試驗通過研究ESR等5個功能基因在淳安花豬群體中的多態(tài)性，探討其繁殖、生長、肉質(zhì)等方面的遺傳潛力，為進一步發(fā)掘其優(yōu)良種質(zhì)特性、開展保護利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品采集 淳安花豬耳組織樣品23份(公5、母18)于浙江省淳安縣主產(chǎn)區(qū)采集，將樣品置于裝有75%乙醇的離心管中，常溫帶回實驗室，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2基因組DNA提取 豬耳組織總DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》，應(yīng)用常規(guī)的酚/氯仿法抽提。

1.3PCR引物設(shè)計與合成 參照GenBank所提供的基因序列設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 各基因引物信息

蛋白酶K、Tris飽和酚、瓊脂糖購自華美生物工程公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)。

1.4PCR反應(yīng)體系與程序 PCR擴增反應(yīng)體系組成：DNA模板100 ng，10×buffer 2.5 μL，25 mM鎂離子2 μL，10 mM dNTP 0.5 μL，混合引物(上游引物和下游引物各為10 pmol/μL)0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，加水至25 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s；54.6℃-64.8℃退火45 s；72℃延伸1 min；進行33-35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.5PCR產(chǎn)物的酶切與判型 除FSHβ基因擴增產(chǎn)物直接電泳檢測外，ESR、GH、MC4R、RYR1基因擴增產(chǎn)物分別用PvuⅡ、MSPI、TagI、Hha限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切反應(yīng)體系分別為：PCR產(chǎn)物(10 μL、8 μL、15 μL、10 μL、10 μL)，內(nèi)切酶(2 U、5 U、10 U、10 U、8 U)，加10×Buffer(含BSA)、ddH2O至20 μL，37℃恒溫水浴鍋中消化2.5-5 h；用3.5%的瓊脂糖凝膠電泳，采用DNA Ladder Markers作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)對照，觀察酶切結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照，由帶型判斷基因型。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.6.1基因頻率和基因型頻率的計算

基因型頻率=基因型個數(shù)/測定群體總數(shù)；

基因頻率：

p是等位基因A的基因頻率，q是等位基因B的基因頻率，nAA、nAB和nBB分別是群體中基因型AA、AB和BB型的個體數(shù)。

1.6.2哈迪-溫伯格平衡檢驗 哈迪-溫伯格平衡檢驗公式如下：

Ei為理論值，Oi為實際觀察值，n為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1ESR基因 PCR-RFLP電泳結(jié)果如圖1所示。用PvuⅡ酶切后產(chǎn)生120 bp片段為AA型，65/55 bp片段為BB型，同時出現(xiàn)120/65/55 bp片段為AB型。

淳安花豬ESR基因型和基因頻率結(jié)果見表2，淳安花豬只出現(xiàn)2個基因型。其中BB基因型頻率為0.64，AB基因型為0.36。A、B等位基因頻率分別為0.18和0.82。對該基因的遺傳分布進行哈迪-溫伯格平衡的x2適合性檢驗，可知ESR基因在淳安花豬群體中的分布符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。

圖1 ESR基因PCR-PvuⅡ-RFLP酶切結(jié)果

2.2FSHβ基因 由于存在基因插入，因此PCR就可以直接檢測FSHβ基因的多態(tài)性，詳見圖2。只出現(xiàn)500 bp條帶的為AA型，只出現(xiàn)200 bp條帶的為BB型，同時出現(xiàn)500/200 bp條帶的為AB型。

淳安花豬FSHβ基因分型檢測結(jié)果見表2。淳安花豬FSHβ基因存在3個基因型，其中AB基因型頻率最高為0.68，AA基因型次之為0.18，BB基因型最低為0.14。A、B等位基因頻率分別為0.52和0.48。各基因型在淳安花豬群體中的分布符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。

圖2 FSHβ基因PCR酶切結(jié)果

2.3GH基因 PCR-RFLP電泳結(jié)果如圖3所示。用MSPI酶切后產(chǎn)生284/222 bp片段為AA型，222/147/136 bp片段為BB型，同時出現(xiàn)284/222/147/136 bp片段為AB型。

淳安花豬GH基因型和基因頻率結(jié)果見表2。淳安花豬只出現(xiàn)2個基因型，其中BB基因型頻率為0.94，AB基因型為0.06。A、B等位基因頻率分別為0.03和0.97。各基因型在淳安花豬群體中的分布符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。

圖3 GH基因PCR-MSPI-RFLP酶切結(jié)果

2.4MC4R基因 PCR-RFLP電泳結(jié)果如圖4所示。用TagI酶切后產(chǎn)生156/70 bp片段為AA型，226 bp片段為BB型，同時出現(xiàn)226/156/70 bp片段為AB型。

淳安花豬MC4R基因型和基因頻率結(jié)果見表2。淳安花豬MC4R基因只有一種基因型AA型。

圖4 MC4R基因PCR-TagI-RFLP酶切結(jié)果

2.5RYR1基因 PCR-RFLP電泳結(jié)果如圖5所示。用Hha酶切后產(chǎn)生186 bp片段為AA型，126/60 bp片段為BB型，同時出現(xiàn)186/126/60 bp片段為AB型。

淳安花豬RYR1基因型和基因頻率結(jié)果見表2。淳安花豬RYR1基因只有一種基因型BB型。

圖5 RYR1基因PCR-Hha-RFLP酶切結(jié)果

基因樣本數(shù)基因型AAABBB基因頻率ABχ2值P值ESR220.000.36(8)0.64(14)0.180.822.660.10FSHβ220.18(4)0.68(15)0.14(3)0.520.482.950.09GH160.000.06(1)0.94(15)0.030.970.020.90MC4R231.00(23)0.000.001.000.00--RYR1190.000.001.00(19)0.001.00--

3 小結(jié)與討論

3.1淳安花豬繁殖性能主效基因 豬的繁殖性狀是一個重要的經(jīng)濟性狀，繁殖性能的高低將直接影響到豬場生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益[5]。

一般認為，一個基因的效應(yīng)(兩種純合基因型的基因型值之差)達到0.5～1.0表型標(biāo)準(zhǔn)差時，可將其看作主效基因。ESR基因?qū)ε咛サ纳L發(fā)育具有重要作用，Short T等(1997)[6]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因的不同基因型與母豬頭胎高窩產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)。陳克飛等(2000)[7]研究認為，ESR基因的BB基因型母豬要比AA基因型母豬每胎多產(chǎn)活仔0.63～3.58頭。FSHβ是垂體前葉分泌的糖蛋白，主要刺激卵泡生長發(fā)育，與促黃體素協(xié)同作用激發(fā)卵泡成熟并誘發(fā)排卵[8]。有報道顯示，大多數(shù)地方豬種FSHβ大多是A等位基因占優(yōu)[9-11]。

本試驗結(jié)果表明，淳安花豬FSHβ也是A等位基因占優(yōu)，與國內(nèi)大多數(shù)報道的地方豬種研究結(jié)果一致。而淳安花豬ESR無AA基因型，BB基因型占優(yōu)，提示淳安花豬具有較高的繁殖性能。

3.2淳安花豬生長性能相關(guān)基因MC4R為肽類物質(zhì)，由下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌，是黑皮質(zhì)素受體家族的主要成員之一[12]。主要作用是通過與腦部分泌的天然內(nèi)源配體α-促黑激素結(jié)合，從而達到抑制體重增加的效果[13]。這種機制深刻影響著動物的背膘厚、日增重和采食量等生長性狀[14-15]。

陳敏等(2005)[16]研究發(fā)現(xiàn)，MC4R在地方豬種中以AA和AB基因型為主，AA基因型表現(xiàn)出更久的飼養(yǎng)期、更厚的背膘和更低的瘦肉率。GH是由垂體前葉中嗜酸性細胞合成和分泌的單鏈多肽激素，具有調(diào)節(jié)脂類、糖類和蛋白質(zhì)代謝，促進生長等作用[17]。經(jīng)榮斌等(2003)[18]認為，GH的等位基因A可能對瘦肉率呈正效應(yīng)，對產(chǎn)仔數(shù)呈負效應(yīng)。

本次試驗，淳安花豬MC4R只有一種基因型AA，GH的B等位基因頻率達0.97，提示淳安花豬瘦肉率較低，生長周期較長。

3.3淳安花豬肉質(zhì)相關(guān)基因 豬應(yīng)激綜合征(PSS)是指豬在應(yīng)激因子(如運輸、轉(zhuǎn)欄、高溫、預(yù)防注射和配種等)的作用下誘發(fā)的一種綜合征候[19]。這種豬往往以異常高的頻率產(chǎn)生劣質(zhì)的PSE肉，可給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟損失。RYR1基因又稱氟烷基因，已證明為豬應(yīng)激綜合征發(fā)生的主效基因。有研究表明，RYR1與豬應(yīng)激性及PSE肉密切相關(guān)[20-21]。

劉文舉等(2008)[22]研究發(fā)現(xiàn)，外來豬種含應(yīng)激敏感AA基因型，而地方豬種只有BB抗應(yīng)激基因型。淳安花豬的研究分析結(jié)果與其基本一致，提示淳安花豬抗應(yīng)激性較好。

[1] 章學(xué)東, 祝榮, 王初昌，等. 淳安花豬產(chǎn)區(qū)調(diào)研分析[J]. 杭州農(nóng)業(yè)與科技，2009, (2): 17.

[2] 樓立峰, 章學(xué)東, 蔡和平，等. 淳安花豬亟待保護[J]. 杭州農(nóng)業(yè)與科技，2006, (5): 25-25.

[3] 祝榮. 淳安花豬種質(zhì)資源保護利用及特色文化建設(shè)[J]. 中國豬業(yè)，2012, 7(5): 23-24.

[4] 李慶海, 章學(xué)東, 范京輝，等. 淳安花豬的品質(zhì)特性介紹[J]. 杭州農(nóng)業(yè)與科技，2010, (5): 48.

[5] 曹果清. 豬 PRLR 基因和 FSHβ 亞基基因多態(tài)性研究 [D]: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[6] Short T, Rothschild M, Southwood O. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines[J]. Journal of Animal Science，1997, 75(12): 3138-3142.

[7] 陳克飛, 李寧. 豬雌激素受體 (ESR) 基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)性狀的影響[J]. 遺傳學(xué)報，2000, 27(10): 853-857.

[8] Cooke D, Crowe M, Roche J. Gonadotrophin heterogeneity and its role in farm animal reproduction[J]. Animal Reproduction Science，1996, 41(2): 77-99.

[9] 謝飛, 吳晗, 滕尚輝，等. 應(yīng)用 4 個繁殖性狀候選基因?qū)μi群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2008, 40(6): 23-26.

[10] 魯紹雄, 胡曉湘, 連林生，等. 撤壩豬 ESR 和 FSH-β 基因多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版，2009, 24(3): 389-393.

[11] 馮富彥, 李新建, 呂剛，等. 豫南黑豬 FSHβ 亞基基因多態(tài)性研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010, (3): 145-148.

[12] Yeo G, Farooqi I, Challis B. The role of melanocortin signalling in the control of body weight: evidence from human and murine genetic models[J]. Qjm，2000, 93(1): 7-14.

[13] Sinha PS, Schi?th HB, Tatro JB. Roles of the melanocortin-4 receptor in antipyretic and hyperthermic actions of centrally administered α-MSH[J]. Brain research，2004, 1001(1): 150-158.

[14] Zhang C-L, Wang Y-H, Chen H. Association between variants in the 5′-untranslated region of the bovine MC4R gene and two growth traits in Nanyang cattle[J]. Molecular biology reports，2009, 36(7): 1839-1843.

[15] Jokubka R, Maak S, Kerziene S. Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs[J]. Journal of Animal breeding and Genetics，2006, 123(1): 17-22.

[16] 陳敏, 王愛國, 李寧，等. 中國地方豬種 MC4R 基因頻率的研究 (英文)[C]. 全國畜禽遺傳資源保護與利用學(xué)術(shù)研討會論文集，2005.

[17] Etherton TD, Bauman DE. Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals[J]. Physiological reviews，1998, 78(3): 745-762.

[18] 經(jīng)榮斌, 宋成義, 陶勇，等. 豬GH基因部分突變位點在不同品種中的分布[J]. 揚州大學(xué)學(xué)報: 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2003, 24(1): 30-33.

[19] 劉丑生. 甘肅黑豬合成系 RYR1 基因的 PCR-RFLP 檢測試驗[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)，2002, 32(2): 24-25.

[20] Fujii J, Otsu K, Zorzato F. Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia[J]. Science，1991, 253(5018): 448-451.

[21] 朱礪, 李學(xué)偉, 帥素蓉. 蘭尼定受體基因在新榮昌豬中的分布及其對胴體和肉質(zhì)性狀的效應(yīng)分析[J]. 中國畜牧雜志，2005, 41(4): 14-16.

[22] 劉文舉, 何年華, 左本武，等. 監(jiān)利豬和大監(jiān)豬五個基因的多態(tài)性研究[J]. 養(yǎng)豬，2008, (3): 25-29.