ZEB1及Nestin在高級(jí)別膠質(zhì)瘤初治及配對(duì)復(fù)發(fā)標(biāo)本中的表達(dá)及臨床意義

林才厚， 陳建屏， 王春華， 鄭水順， 祁小龍， 石松生

惡性膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)被認(rèn)為是惡性膠質(zhì)瘤高死亡率和致殘率的重要原因[1]。盡管膠質(zhì)瘤的綜合治療手段不斷提高，但大部分高級(jí)別膠質(zhì)瘤的無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)均未超過(guò)7月，而幾乎所有膠質(zhì)瘤患者36月內(nèi)都會(huì)有病情進(jìn)展[2]。因此，研究惡性膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制及與PFS的關(guān)系成了膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

膠質(zhì)瘤上皮間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)治療的耐受被認(rèn)為是目前惡性膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的重要原因[3-4]。ZEB1是膠質(zhì)瘤EMT進(jìn)程的重要啟動(dòng)分子，Nestin則是目前公認(rèn)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)記物[5]。既往的研究大多集中于ZEB1及Nestin在膠質(zhì)瘤上的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系[5-8],而對(duì)于膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前后ZEB1及Nestin表達(dá)變化的研究甚少，特別是高級(jí)別膠質(zhì)瘤ZEB1或Nestin表達(dá)與PFS的關(guān)系更是鮮有報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)法和圖像分析技術(shù)對(duì)39例高級(jí)別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前后石蠟標(biāo)本中的ZEB1及Nestin進(jìn)行檢測(cè)，探討這2個(gè)指標(biāo)與患者PFS的相關(guān)性，及其在膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)中的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2008年1月-2013年1月于筆者單位接受手術(shù)治療及規(guī)范放化療的高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者39例，男性19例，女性20例，年齡(50.08±9.38)歲(35～71歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均為原發(fā)膠質(zhì)瘤，且初次行膠質(zhì)瘤全切術(shù)，術(shù)后行規(guī)范化放療及替莫唑胺化療，由同一醫(yī)院定期隨訪，第2次手術(shù)仍在同一醫(yī)院進(jìn)行；(2)無(wú)其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾?。?3)有完整規(guī)范的術(shù)后病理報(bào)告、影像學(xué)資料及隨訪報(bào)告；(4)KPS>70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者非正常死亡；(2)隨訪中斷患者。取患者初次及第2次手術(shù)的石蠟標(biāo)本進(jìn)行研究。

另收集同期就診的因顱腦外傷行腦減壓術(shù)的患者10例，男性6例，女性4例，年齡(39.7±12.69)歲(25～72歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前身體健康，無(wú)其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病，頭顱CT檢查排除腦腫瘤性病變。取正常腦組織石蠟標(biāo)本作為對(duì)照。對(duì)所有納入研究的患者進(jìn)行為期60月的隨訪，以患者死亡作為終點(diǎn)事件。所有研究事項(xiàng)均與患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1材料 ZEB1兔多克隆抗體(貨號(hào)：HPA027524，美國(guó)Sigma公司)；Nestin兔單克隆抗體(貨號(hào)：ab105389，英國(guó)Abcam公司)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟切片經(jīng)烤片及脫蠟水化后，用枸櫞酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶，正常羊血清封閉，洗凈后孵育一抗，4 ℃過(guò)夜。加二抗室溫孵育20 min，經(jīng)DAB顯色和蘇木精復(fù)染后，脫水封片。

1.2.3免疫組織化學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片，ZEB1及Nestin陽(yáng)性染色鏡下呈棕黃色或棕褐色，在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析處理軟件計(jì)算ZEB1及Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度，代表ZEB1及Nestin的表達(dá)水平，并根據(jù)平均光密度的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組[9]。

1.3隨訪 通過(guò)查閱病歷資料采集患者的臨床基本信息，包括影像學(xué)資料，并制定隨訪表，主要采用電話(huà)和門(mén)診隨訪2種方式。影像學(xué)中壞死、衛(wèi)星灶、囊變及腫瘤大小的區(qū)分參照文獻(xiàn)[10]，并由2位神經(jīng)外科醫(yī)師和2位神經(jīng)影像學(xué)醫(yī)師共同判斷結(jié)果。PFS定義為：患者第一次規(guī)范治療后至臨床隨訪判斷腫瘤再次進(jìn)展或者影像學(xué)檢測(cè)提示腫瘤復(fù)發(fā)。

2 結(jié) 果

2.1ZEB1及Nestin在高級(jí)別膠質(zhì)瘤上復(fù)發(fā)前后的表達(dá) ZEB1在正常腦組織和復(fù)發(fā)前后的惡性膠質(zhì)瘤腦組織中均有不同程度表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上(圖1)。膠質(zhì)瘤腦組織的ZEB1表達(dá)，復(fù)發(fā)前比正常腦組織明顯增高[(0.609±0.133)vs(0.426±0.026 1),P<0.01]，復(fù)發(fā)后也較復(fù)發(fā)前明顯增高[(0.703±0.176)vs(0.609±0.133),P<0.01]。Nestin在復(fù)發(fā)前后的惡性膠質(zhì)瘤腦組織中呈不同程度表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。膠質(zhì)瘤腦組織的Nestin表達(dá)，復(fù)發(fā)后較復(fù)發(fā)前明顯增高[(0.375±0.096 6)vs(0.333±0.071 0)，P=0.014]。

A～C：ZEB1在正常腦組織和同一例高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)前后的表達(dá)，復(fù)發(fā)后ZEB1表達(dá)明顯高于復(fù)發(fā)前和正常腦組織；D～E：Nestin在同一例高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)前后的表達(dá)，復(fù)發(fā)后表達(dá)明顯高于復(fù)發(fā)前.圖1 ZEB1和Nestin在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(H-E染色 ×400)Fig 1 Expression of ZEB1 and Nestin in high grade gliomas(H-E staining ×400)

2.2高級(jí)別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前ZEB1及Nestin表達(dá)與PFS的關(guān)系 根據(jù)復(fù)發(fā)前ZEB1及Nestin表達(dá)的平均光密度的中位數(shù)(0.643及0.337)將高級(jí)別膠質(zhì)瘤分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。單因素分析顯示，ZEB1與Nestin與高級(jí)別膠質(zhì)瘤的PFS有關(guān)(圖2，表1)。Spearman法分析顯示，隨著Nestin表達(dá)增高，ZEB1表達(dá)明顯增高。相關(guān)性分析顯示，高級(jí)別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)前ZEB1的表達(dá)與Nestin的表達(dá)存在顯著正相關(guān)(rs=0.670,P<0.001)。

PFS：無(wú)進(jìn)展生存期. A：ZEB1低表達(dá)組較高表達(dá)組PFS長(zhǎng)，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，P<0.001； B：Nestin低表達(dá)組較高表達(dá)組PFS長(zhǎng)，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，P=0.004； C：Spearman法分析顯示，ZEB1表達(dá)與Nestin表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.670,P<0.001).圖2 ZEB1及Nestin表達(dá)與PFS的關(guān)系及ZEB1表達(dá)與Nestin表達(dá)的相關(guān)性Fig 2 The relationship of ZEB1, Nestin expression with PFS, and the correlation between ZEB1 expression and Nestin expression

表1 影響高級(jí)別膠質(zhì)瘤PFS的臨床指標(biāo)的單因素分析

PFS：無(wú)進(jìn)展生存期.

2.3高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者PFS影響因素的單因素和多因素分析 單因素分析顯示，年齡(50歲為界)、衛(wèi)星灶、壞死、ZEB1表達(dá)及Nestin表達(dá)與規(guī)范化治療后高級(jí)別膠質(zhì)瘤的PFS有相關(guān)性(表1)，而性別、病理分級(jí)、囊變及腫瘤大小(4 cm為界)與高級(jí)別膠質(zhì)瘤的PFS無(wú)明顯相關(guān)。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，采用逐步回歸分析法，將單因素分析有意義的5種因素，包括年齡、衛(wèi)星灶、壞死、ZEB1表達(dá)及Nestin表達(dá)進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，ZEB1表達(dá)為影響腫瘤PFS的獨(dú)立因素(95%CI：3.016～19.194，P<0.001)。

3 討 論

體外研究表明，高級(jí)別膠質(zhì)瘤中因膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)治療的抵抗導(dǎo)致其復(fù)發(fā)是其預(yù)后差的根本原因[11]，而有關(guān)體內(nèi)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)與初治標(biāo)本中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)差別的研究甚少。Nestin是經(jīng)典的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)記物[12]。本研究中，相較于初治標(biāo)本，復(fù)發(fā)標(biāo)本的Nestin較高，這意味著復(fù)發(fā)高級(jí)別膠質(zhì)瘤中，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞比例增加。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是高級(jí)別膠質(zhì)瘤治療抵抗的根本原因[13]，這從某種程度上解釋了復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為更加惡性、對(duì)治療的反應(yīng)性明顯降低的原因，與體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果基本一致。復(fù)發(fā)后的高級(jí)別膠質(zhì)瘤不僅對(duì)治療耐藥，而且更具有侵襲性。越來(lái)越多研究表明，EMT進(jìn)程的關(guān)鍵分子ZEB1參與了高級(jí)別膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)侵襲過(guò)程[14]。本研究中，復(fù)發(fā)標(biāo)本ZEB1表達(dá)較初治標(biāo)本高，意味著復(fù)發(fā)后的膠質(zhì)瘤更具有侵襲性，這與臨床上復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤更具有侵襲性、惡性度更高一致[1,15]。更為有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1表達(dá)與Nestin表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明高級(jí)別膠質(zhì)瘤在復(fù)發(fā)的過(guò)程中，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不僅比例增高，而且很可能也參與了高級(jí)別膠質(zhì)瘤的EMT進(jìn)程，與最新的研究成果基本一致[16]。

腫瘤的PFS被認(rèn)為可在短時(shí)間及持續(xù)時(shí)間內(nèi)反映腫瘤治療過(guò)程中疾病的進(jìn)展情況，對(duì)評(píng)價(jià)治療策略具有重要的臨床意義[17]。本研究經(jīng)單因素分析顯示，Nestin表達(dá)、年齡、衛(wèi)星灶及壞死與高級(jí)別膠質(zhì)瘤中PFS有關(guān)，與既往研究基本一致[12,18-20]。多因素分析顯示，ZEB1表達(dá)是影響高級(jí)別膠質(zhì)瘤PFS的獨(dú)立因素，而年齡、衛(wèi)星灶、壞死及Nestin表達(dá)并不是獨(dú)立因素。這與有的研究不一樣，歸結(jié)于跟病例選擇有關(guān)。本研究選擇的是配對(duì)病例，且KPS>70分，患者均經(jīng)過(guò)手術(shù)全切及規(guī)范化的放化療，可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響?？梢?jiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)和侵襲具有重要作用，對(duì)臨床認(rèn)識(shí)高級(jí)別膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)進(jìn)程具有一定的意義。

綜上分析，ZEB1在腫瘤復(fù)發(fā)標(biāo)本中的表達(dá)較初治標(biāo)本明顯升高，而且是影響高級(jí)別膠質(zhì)瘤PFS的獨(dú)立因素，ZEB1可能是未來(lái)預(yù)防高級(jí)別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)重要分子。本研究也存在一些不足之處，本研究只停留在免疫組織化學(xué)水平，尚缺乏在細(xì)胞、動(dòng)物及分子水平的研究，且標(biāo)本量偏小。未來(lái)的研究應(yīng)擴(kuò)充樣本量，并開(kāi)展多水平如細(xì)胞、動(dòng)物和分子水平的研究，以充分驗(yàn)證該研究結(jié)果。