飼料及乳制品中黃曲霉毒素的檢測

高 晶，袁建振，侯扶江，常生華，王召鋒，傅 華，王 靜(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

近年來，乳制品中霉菌毒素感染的問題逐漸引起大眾的關(guān)注。2011年，蒙牛集團(tuán)被抽查出其牛奶中黃曲霉毒素M1(aflatoxin，AFM1)超標(biāo)140%，引發(fā)了消費(fèi)者對乳制品安全問題的質(zhì)疑。黃曲霉毒素于20世紀(jì)60年代初被發(fā)現(xiàn)，其主要是由黃曲霉菌(Aspergillusflavus)、集蜂曲霉菌(Aspergillusfumigatus)以及寄生曲霉菌(Aspergillusniger)等產(chǎn)毒真菌所產(chǎn)生的一大類次生代謝產(chǎn)物[1-3]，是目前已知的致癌性、致畸形和致突變性最強(qiáng)的一種化學(xué)物質(zhì)。動物或人體攝入含有黃曲霉毒素的物質(zhì)后，會出現(xiàn)個體發(fā)育遲緩、抵抗力降低甚至死亡現(xiàn)象[4]。

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，在越來越多的國家中，奶業(yè)已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)[5]。在影響奶業(yè)發(fā)展的重要因素中，牧草飼料占40%，飼養(yǎng)管理占25%，氣候條件占20%，而遺傳因素為15%[6]。因此，牧草飼料是奶業(yè)的基礎(chǔ)，對奶業(yè)發(fā)展有著至關(guān)重要的影響。優(yōu)質(zhì)牧草是反芻動物粗飼料的主要組成部分[7-8]，當(dāng)飼草的品質(zhì)提高時，反芻動物的采食量和日產(chǎn)奶量才會隨之增加[9]。牛羊飼養(yǎng)戶和牧場主為了保證家畜在冬春季節(jié)的營養(yǎng)需要，會將夏秋收割的牧草進(jìn)行貯存，牧草的貯存是一個重要的生產(chǎn)環(huán)節(jié)。有時收割后的牧草沒有迅速干燥，或者在晾曬過程中遇到雨雪天氣，就很容易發(fā)生霉變，產(chǎn)生黃曲霉毒素，從而進(jìn)入反芻動物與人類的食物鏈。因此，有必要在牧草飼料貯存環(huán)節(jié)中加強(qiáng)管理，及時對飼料以及乳制品中的黃曲霉毒素含量進(jìn)行檢測，從而提高飼料和乳制品的品質(zhì)，保障動物和人類的健康。目前，已有學(xué)者對食品中黃曲霉毒素的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述[10-11]，而對飼料以及乳制品中黃曲霉毒素檢測方法的探討較少。由于大多數(shù)情況下飼料是否發(fā)生霉變無法通過肉眼分辨，很難做到及時發(fā)現(xiàn)和處理，因此本文在對飼料及乳制品中黃曲霉毒素的來源、危害、檢測技術(shù)以及預(yù)防措施進(jìn)行綜述的同時，著重強(qiáng)調(diào)黃曲霉毒素檢測技術(shù)，以期為在草業(yè)和畜牧業(yè)的生產(chǎn)實(shí)踐中準(zhǔn)確、快速和實(shí)時地檢測飼料及乳制品中黃曲霉毒素的含量提供理論依據(jù)與指導(dǎo)。

1 黃曲霉毒素的理化性質(zhì)

目前已成功分離鑒定出的黃曲霉毒素衍生物大約有20多種，其中Aflatoxin B1(AFB1)、Aflatoxin B2(AFB2)、Aflatoxin G1(AFG1)和Aflatoxin G2(AFG2)是天然產(chǎn)生的毒性最強(qiáng)，并且對農(nóng)作物污染最為嚴(yán)重的4種化合物[12-13]。當(dāng)反芻動物攝入了被AFB1和AFB2污染的飼料后，會在體內(nèi)代謝產(chǎn)生AFM1和Aflatoxin M2(AFM2)兩種化合物，并且一般會分泌到乳汁中[14-15]。6種化合物(圖1)的毒性大小依次為AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG2>AFM2[16]。其中，Aflatoxin B1(AFB1)的毒性極強(qiáng)，是砒霜的68倍[17]；AFM1的毒性約為AFB1毒性的2%～10%[18]。由于黃曲霉毒素的理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，分解溫度達(dá)到268 ℃，用普通的烹調(diào)、高溫滅菌和加工等方法都很難破壞其毒性，并且迄今為止，針對黃曲霉毒素中毒還未有特效治療藥物[19-20]，因此，世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)已分別于1993年和2002年將AFB1和AFM1列為人類Ⅰ類致癌物質(zhì)[21-22]。

圖1 飼料及乳制品中常見的6種黃曲霉毒素Fig. 1 Six aflatoxins commonly found in feed and dairy products

2 黃曲霉毒素對飼料品質(zhì)的危害

隨著飼料業(yè)的發(fā)展，人們對牧草飼料的品質(zhì)包括營養(yǎng)價值、適口性和安全性等方面的要求在逐漸提高[23]。牧草飼料在收割、貯運(yùn)過程中受潮容易霉變，從而產(chǎn)生黃曲霉毒素。霉變的飼料會產(chǎn)生不良?xì)馕?，酸度上升，營養(yǎng)成分被嚴(yán)重破壞，會使飼料逐漸甚至完全喪失飼喂價值[24-25]。Bartov等[26]研究表明，在貯存過程中，發(fā)生霉變的玉米(Zeamays)中脂肪含量從3.8%降至2.4%；維生素E含量從22.1%下降到20.6%；胡蘿卜素的含量從3.1 mg·kg-1下降到2.3 mg·kg-1。如果將霉變的飼料用來飼喂動物，由于飼料已經(jīng)失去了原有的鮮味甚至帶有異味，會使動物的采食量嚴(yán)重下降[27-28]；即使采食，也會因?yàn)闋I養(yǎng)物質(zhì)的損失以及產(chǎn)生的黃曲霉毒素影響動物的健康，導(dǎo)致其產(chǎn)生不適感甚至中毒[29-31]。AFB1普遍存在于發(fā)生霉變的糧食作物中，根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)的統(tǒng)計，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%都受到了霉菌毒素的污染[32]。因此，我國衛(wèi)生部發(fā)布并實(shí)施了食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2001和GB 2761-2011，對飼料以及飼料添加劑中的AFB1最高限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了規(guī)定[33-34](表1)。

表1 我國飼料以及飼料添加劑中黃曲霉毒素B1的限量標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard limits of AFB1 in feed and feed additives in China

3 黃曲霉毒素對動物健康的危害

動物對黃曲霉毒素較為敏感，通常高劑量的黃曲霉毒素會導(dǎo)致動物急性死亡，而長時間攝入低劑量的黃曲霉毒素會損壞動物的肝功能、生長性能、生殖系統(tǒng)、免疫機(jī)能以及造血功能等。

黃曲霉毒素能對動物肝臟產(chǎn)生很大的毒害作用，導(dǎo)致白蛋白濃度、血清總蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶這4項(xiàng)反映肝臟功能的重要指標(biāo)活性的升高。Siloto等[35]研究發(fā)現(xiàn)，用添加了1 mg·kg-1黃曲霉毒素的日糧飼喂蛋雞，會導(dǎo)致蛋雞的肝臟發(fā)生病變。Fetaih等[36]研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠注射1 mg·kg-1的AFB1后可導(dǎo)致雌鼠的肝臟、腎臟等內(nèi)臟受損。

黃曲霉毒素可以通過降低一些胰腺酶的活性，抑制淀粉酶、胰蛋白酶和其它激素的合成，從而損害動物的生長性能。在飼料中添加500 μg·kg-1的低劑量黃曲霉毒素后，豬的采食量下降，日增重減少，生長緩慢[37]。奶牛采食了含有高劑量AFB1(213.6 μg·kg-1)的羊草(Leymuschinensis)后死亡，其胃壁損傷嚴(yán)重，腸黏膜粘連，小腸潰爛，并伴有肝臟腫大出血[38]。

黃曲霉毒素會損害動物的生殖系統(tǒng)，極易導(dǎo)致雌性動物產(chǎn)生卵巢畸形、萎縮以及子宮腫脹、擴(kuò)張等癥狀，容易引發(fā)雌性動物流產(chǎn)或者死胎；還會引發(fā)雄性動物睪丸萎縮、雌性化。給雄性維斯塔鼠注射不同劑量(10、20、50 μg·kg-1)的AFB1，會導(dǎo)致其精子數(shù)量和生殖器官的相對比重減少，并且睪丸素以及睪丸類固醇合成酶的水平也會明顯降低[39]。

黃曲霉毒素可以在分子水平上與DNA和RNA結(jié)合，干擾基因復(fù)制和表達(dá)，影響蛋白質(zhì)的合成，延遲淋巴因子的激活，使淋巴細(xì)胞產(chǎn)生減少，從而抑制機(jī)體的免疫機(jī)能。Mehrzad等[40]使用0.5 ng·mL-1的AFB1處理牛血液中的中性粒細(xì)胞3 h后發(fā)現(xiàn)，AFB1降低了中性粒細(xì)胞對葡萄球菌與大腸桿菌的吞噬和殺死功能，因此得出AFB1可以抑制牛的非特異性免疫功能的結(jié)論。

黃曲霉毒素會對動物的造血功能造成影響。黃曲霉毒素可以使血液中的血漿蛋白量、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)明顯降低，易破壞部分血凝素。李瑞娟等[41]用含有不同濃度AFB1(0、2.8、4.2、5.6 mg·kg-1)的飼料連續(xù)飼喂雛雞14 d，結(jié)果表明，血液中的白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、紅細(xì)胞積壓(HCT)、血小板(PLT)、血紅蛋白(HGB)含量均呈降低趨勢，在AFB1濃度為2.8 mg·kg-1時的血液生理指數(shù)顯著降低，開始出現(xiàn)貧血癥狀。

4 黃曲霉毒素在乳汁中的分泌及對人類的危害

當(dāng)AFM1隨乳制品進(jìn)入人體時，會對人體的血液、肌肉和內(nèi)臟器官產(chǎn)生不同程度的傷害，其中對腎臟和肝臟的損傷最大。黃曲霉毒素在反芻動物體內(nèi)的代謝非常迅速，反芻動物采食了被AFB1污染的飼草，12 h后可在乳汁中檢測到AFM1，并在24 h達(dá)到最高濃度[42]。動物在停止采食含有AFB1的飼草4 d后，其乳汁中的黃曲霉毒素才會消失[43]。泌乳母羊?qū)︼暳现蠥FB1的攝入量與所產(chǎn)乳汁中AFM1含量的轉(zhuǎn)化率介于0.1%～6%[44]。

乳制品受到AFM1污染是全世界范圍的問題。如Rama等[45]對科索沃的原料奶和UHT(超高溫瞬時滅菌)奶共895個樣本中的AFM1檢測后發(fā)現(xiàn)，有2.8%的原料奶和2.6%的UHT奶樣品中檢測到AFM1，其污染含量在5～50 ng·L-1。又如Chavarría等[46]對哥斯達(dá)黎加上市乳制品中共210個樣本中的AFM1進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明，在檢出含有黃曲霉毒素的30個牛奶樣品和10個奶酪樣品中，AFM1濃度分別為19～629和31～276 ng·L-1，平均值分別為136和74 ng·L-1，超過了歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)。再如Han等[47]對我國十大牛奶生產(chǎn)地區(qū)的牛奶共計200個樣本進(jìn)行了檢測，AFM1的檢出率為23.5%(表2)。鑒于乳制品受到AFM1污染的普遍性，大多數(shù)國家都立法規(guī)定了乳制品中AFM1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)(表3)。

5 黃曲霉毒素的檢測方法

目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層分析法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、免疫分析法、生物傳感器法以及毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)，這些方法都有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

薄層分析法是測定食品和飼料中黃曲霉毒素含量的傳統(tǒng)檢測方法，并且應(yīng)用非常廣泛。薄層分析法的原理是，用合適的萃取溶劑將黃曲霉毒素從樣品中萃取出來，經(jīng)過柱層析凈化后，將收集的黃曲霉毒素在薄層板上進(jìn)行層析，根據(jù)黃曲霉毒素形成熒光斑的強(qiáng)弱程度與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，從而確定樣品中黃曲霉毒素的含量。薄層分析法分為單項(xiàng)展開法和雙向展開法，雙向展開法的操作步驟繁多，用時長，但是可以很好地去除雜質(zhì)，通常對于比較復(fù)雜的樣品，需要使用雙向展開法才能獲得較好的靈敏度[48]。

表2 中國十大產(chǎn)奶地區(qū)原料奶中AFM1的含量Table 2 Concentrations of AFM1 in the raw milk samples from ten areas in China

表3 世界部分國家和組織對奶及奶產(chǎn)品中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Standard limits of AFM1 in milk in some countries and organizations

高效液相色譜法是近年來發(fā)展最快的一種黃曲霉毒素檢測技術(shù)。其檢測原理是以液體為流動相，將樣品帶入到裝有固定相的色譜柱上，通過調(diào)節(jié)流動相中溶劑的比例和極性，影響樣品中各化合物在流動相與固定相之間的分配，使得黃曲霉毒素與其它化合物分離后到達(dá)檢測器，從而實(shí)現(xiàn)對樣品定性和定量的分析。高效液相色譜法檢測精確度高，靈敏度和重現(xiàn)性較好。例如Bellio等[49]用高效液相色譜法對意大利北部采集的奶樣進(jìn)行AFM1檢測，方法的線性范圍為0.75～25 μg·mL-1，平均回收率為93%～96%。屈俊成等[50]用高效液相色譜法對0～60 ng·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.999 9，平均回收率為85%～90%;對飼料中的AFB1進(jìn)行檢測，相對偏差為4.22%。高效液相色譜法一般使用免疫親和柱來對樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行進(jìn)樣前的分離純化，并且有很好的純化效果[48]，因此，該法的使用范圍最廣。但是，高效液相色譜法的局限性在于前處理方法繁瑣，對操作人員技術(shù)要求高，檢測周期長，以及儀器設(shè)備昂貴等。

免疫分析法的原理是通過抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測提取目標(biāo)化合物。其檢測成本低，操作簡單，重現(xiàn)性好，并且其靈敏度和特異性比薄層色譜法好。免疫分析法一般包括3種：金標(biāo)免疫層析法(gold labeled immuno-chromatographic assay，GICA)、免疫親和柱(immuno affinity chromatography，IAC)熒光光度法和酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。金標(biāo)免疫層析法是一種固相免疫法，利用抗體和抗原的特異性結(jié)合，一步完成對黃曲霉毒素的檢測。趙曉聯(lián)等[51]用金標(biāo)免疫層析法對糧油食品中的AFB1進(jìn)行檢測，最低檢測限為2.5 ng·mL-1，靈敏度較高，可以在5～15 min內(nèi)完成對所測樣品中黃曲霉毒素的定性檢測。金標(biāo)試紙法操作簡單迅速，試紙在4 ℃的環(huán)境下可以穩(wěn)定10個月以上，不需要借助任何實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器，對場地也沒有特殊要求，在農(nóng)田、倉庫等地方均可以進(jìn)行方便快速的檢測[52]，但是其檢測的精確度和準(zhǔn)確性仍然有待提高。

在免疫親和柱-熒光光度法中，免疫親和柱的固相是以共價鍵結(jié)合了抗體的惰性微珠。當(dāng)抗原溶液通過免疫親和柱時，柱上的抗體會對黃曲霉毒素抗原產(chǎn)生特異性吸附，而其它化合物則沿柱流下，最后用合適的洗脫液洗脫抗原，從而將目標(biāo)化合物純化，之后借助紫外燈和熒光計，對洗脫的物質(zhì)進(jìn)行檢測。王偉等[53]使用免疫親和柱-熒光光度法對牛奶中的AFM1進(jìn)行檢測，其檢測限為0.1 μg·kg-1，檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，回收率為88%～93%。該方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測速度快，處理一個樣品的時間為10～15 min，適用于大量樣品的處理，且定量準(zhǔn)確，此外操作人員無需使用有毒有害溶劑，既保證操作人員的安全性，也減少了對壞境的污染，但是該方法需要配備專門的儀器設(shè)備，檢測費(fèi)用高。

酶聯(lián)免疫法是近幾年研究出的較為新穎的檢測方法。酶聯(lián)免疫法測定的對象可以是抗體也可以是抗原，其原理是采用抗原與抗體的特異性反應(yīng)將待測物與酶連接起來，通過酶與底物的顯色反應(yīng)，結(jié)合酶標(biāo)儀，根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或者定量的分析[48]。如Omar[54]使用酶聯(lián)免疫法對約旦鮮奶樣品中的AFM1進(jìn)行檢測，通過在鮮奶中加入不同濃度(20、100、300 ng·L-1)的AFM1標(biāo)準(zhǔn)品，得到的回收率分別為102.1%、94%和99%，并且重復(fù)性較好。酶聯(lián)免疫法可高效、快速地檢測樣品中黃曲霉毒素的含量，在飼料的測定方法中被國標(biāo)所推薦，對人體的危害小，但是其也有一定的缺陷性，如需要配備專門的儀器，試劑盒中的試劑壽命短、需低溫保存，檢測結(jié)果重復(fù)性差，假陽性概率高，以及操作復(fù)雜等。

生物傳感器是由固定化的生物敏感材料作識別元件、理化換能器以及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)[55]，是可以探測生物體內(nèi)外的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)或者與其特異性交互作用后產(chǎn)生響應(yīng)的一種裝置。生物傳感器法包括酶傳感器法和免疫傳感器法。

酶傳感器法的原理是將黃曲霉毒素氧化酶固定在開管的多壁納米碳管上，將其用作電極測定AFB1[56]。當(dāng)把黃曲霉毒素氧化還原酶與特異性的AFB1抗體通過在納米碳管上共固定化制成修飾電極時，傳感器的靈敏度可以增加10倍。杜祎等[57]將黃曲霉毒素氧化酶經(jīng)固定化后與過氧化氫電極一起構(gòu)成電流型酶電極，對AFB1檢測的結(jié)果表明，該法與酶聯(lián)免疫法和薄層分析法都有較好的一致性，對AFB1的測定時間是20 s，相對偏差<2%，加標(biāo)回收率為98%～106%。酶傳感器法操作簡便，具有較好的靈敏度。

免疫傳感器法的原理是利用抗原(抗體)對抗體(抗原)的識別功能而研制成的生物傳感器。Parker和Tothill[58]制備了一種電化學(xué)免疫傳感器，對牛奶中AFM1的檢測限為39 ng·L-1，最大響應(yīng)值達(dá)到1 000 ng·L-1。Daly等[59]研制了一種表面等離子共振型光學(xué)免疫傳感器，利用間接競爭檢測法測定AFB1，該免疫傳感器的線性工作范圍為15～100 ng·L-1，檢測限為15 ng·L-1。在這種免疫傳感器的制作過程中，生物分子的定向固定量、活性保留程度等都會影響傳感器的性能，因此還有待進(jìn)一步的研究才能將其用于實(shí)踐?？偠灾飩鞲衅骶哂胁僮骱唵?、響應(yīng)快、選擇性高并且方便攜帶的特點(diǎn)，但是目前該技術(shù)尚不夠成熟，無法同時滿足對靈敏度和穩(wěn)定性的要求，還需進(jìn)一步改善。

毛細(xì)管電泳法是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù),它是依據(jù)樣品中各組分之間的遷移速度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)化合物的分離檢測方法。當(dāng)毛細(xì)管電泳法與激光誘導(dǎo)熒光檢測器連用時，可以很好地提高靈敏度。Arroyomanzanares等[60]用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法檢測AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的混合物時，取得了理想的分離效果，并且該法對AFB2的檢測最為靈敏。由于毛細(xì)管電泳法的操作復(fù)雜，成本也較高，因此目前尚不適于在樣品檢測中廣泛應(yīng)用。

6 黃曲霉毒素的預(yù)防

程傳民等[61]對全國27個省的2 423個飼料原料樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，我國飼料原料中受到黃曲霉毒素污染面很廣，檢出率較高(表4)。其中，以華中地區(qū)受到的污染最為嚴(yán)重，并且不同品種的飼料產(chǎn)品所受到的污染程度也存在較大的差異，其中玉米副產(chǎn)物中的檢出率最高，玉米中的超標(biāo)率最高且最大值達(dá)到了232.4 μg·kg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我國對飼料中黃曲霉毒素的法定標(biāo)準(zhǔn)(表1)。因此，預(yù)防黃曲霉毒素在飼料原料中的發(fā)生非常重要，其中防霉是關(guān)鍵。防霉的主要措施包括嚴(yán)格控制原料及產(chǎn)品的貯存條件、貯存前做殺菌處理以及培育抗產(chǎn)毒和抗侵染的品種3個方面。

首先，牧草等飼料收割貯存時要嚴(yán)格控制貯存條件，包括控制原料及產(chǎn)品的水分、低溫貯存、無氧保存以及保持設(shè)備清潔。飼料在收獲后要迅速進(jìn)行干燥，當(dāng)飼料中的水分低于15%時，霉菌不易繁殖[62-64]；飼料最理想的貯存溫度是12 ℃以下[65]，在這個溫度下害蟲的活動以及繁殖都會停止[66]，當(dāng)水分含量保持在15.5%～17.5%，冷卻至10 ℃后，安全貯存期可以達(dá)到6～10個月[67]；大多數(shù)霉菌在無氧條件下不能生長繁殖[68]，將飼料貯存在充有CO2的密閉空間內(nèi)，對其進(jìn)行包裝，可很大程度保證飼料不發(fā)生霉變，還可以防止蟲害；要保證貯存設(shè)備的清潔度，霉菌在自然界中的分布非常廣泛，粉塵和空氣中都含有霉菌孢子，因此，飼料很容易被自然界中的霉菌孢子污染[69]，務(wù)必要保持飼料收獲到貯存各個環(huán)節(jié)設(shè)備以及場地的衛(wèi)生清潔。

其次，牧草等飼料收割貯存前做殺菌處理，包括使用防霉劑和輻射防霉。適時的應(yīng)用防霉劑，可以延長飼料等貯存品的保質(zhì)期，常用的防霉劑主要包括山梨醇及其鹽類，丙酸及其鹽類，雙乙酸鈉，延胡索酸等[70]；在減少真菌導(dǎo)致食物引起的疾病方面輻射可以發(fā)揮重要作用[71]，美國農(nóng)業(yè)部原子能研究所使用1×106Radγ-射線對飼料和糧食進(jìn)行輻射后發(fā)現(xiàn)，相對濕度80%以上、30 ℃的環(huán)境下，也可以存放45 d以上[72]。

最后，農(nóng)作物抗霉的能力與其遺傳因素有很大關(guān)系，培育抗產(chǎn)毒和抗侵染的品種，農(nóng)作物便可以利用其自身的抗性來抵抗黃曲霉的污染[73]。Bryden[73]研究表明，可以通過培育抗真菌的農(nóng)作物來抵抗黃曲霉的污染，從而降低飼料中黃曲霉毒素的含量。

表4 我國不同生產(chǎn)地區(qū)以及不同飼料原料中AFB1的檢測結(jié)果Table 4 The results of AFB1 detection in different production areas and different feeds in China

7 結(jié)論與展望

隨著消費(fèi)者對食品安全意識的日益增加，乳制品的安全問題也越來越受到關(guān)注。奶牛被飼喂感染有黃曲霉毒素的飼料后，所產(chǎn)的奶中也含有黃曲霉毒素，而即使微量的黃曲霉毒素對動物與人體也會造成巨大的危害。在此，本文對飼料以及乳制品中的黃曲霉毒素從來源、危害、檢測技術(shù)和預(yù)防措施等方面進(jìn)行了綜述，尤其對當(dāng)前的各種檢測技術(shù)進(jìn)行了重點(diǎn)分析。在各種檢測方法中，薄層分析法的樣品前處理復(fù)雜，特異性較差，靈敏度也不高，回收率低，容易造成樣品污染；使用免疫親和柱的方法，雖然特異性較好，但是檢測成本和技術(shù)要求很高；高效液相色譜法所需儀器設(shè)備昂貴，投資較大，檢測成本也比較高，對操作人員的技術(shù)要求高；酶聯(lián)免疫法的方法相對來說，操作方便，污染程度小，靈敏度高，特異性好，成本也較低；生物傳感器的方法操作簡單、響應(yīng)快、選擇性高并且方便攜帶。但是該方法技術(shù)不夠成熟，無法同時滿足對靈敏度和穩(wěn)定性的要求；毛細(xì)管電泳檢測對黃曲霉毒素的分離效果明顯，靈敏度也很高，不需要使用有毒試劑，但是毛細(xì)管電泳法的操作復(fù)雜，成本也很高，不適于在樣品檢測中廣泛應(yīng)用。因此，如果在現(xiàn)有各種方法的基礎(chǔ)上，簡化操作步驟，降低成本，不但可以滿足分析測試的基本要求，還可以促進(jìn)草業(yè)、畜牧業(yè)和奶業(yè)的發(fā)展，從而帶來巨大的生態(tài)、社會和經(jīng)濟(jì)效益。

References:

[1] Li P,Zhang Q,Zhang W.Immunoassays for aflatoxins.Trends in Analytical Chemistry,2009,28(9):1115-1126.

[2] Zhuang Z,Lohmar J M,Satterlee T,Cary J W,Calvo A M.The master transcription factormtfAgoverns aflatoxin production,morphological development and pathogenicity in the fungusAspergillusflavus.Toxins,2016,8(1):29.

[3] Jalili M.A review on aflatoxins reduction in food.Iranian Journal of Health Safety & Environment,2016,3(1):445-459.

[4] 黃祿華,胡昌金,唐臣學(xué),范才良.黃曲霉毒素對奶牛的危害及控制措施.畜禽業(yè),2013(10):26-28.

Huang L H,Hu C J,Tang C X,Fang C L.Harm of Aflatoxins on Dairy Cows and Control Measures.Livestock and Poultry Industry.2013(10):26-28.(in Chinese)

[5] 張潔,史東吉,王召鋒,侯扶江.我國牛奶安全生產(chǎn)現(xiàn)狀及對策.草業(yè)科學(xué),2017,34(1):138-151.

Zhang J,Shi D J,Wang Z F,Hou F J.Situation and countermeasures of milk safety production in China.Pratacultural Science,2017,34(1):138-151.(in Chinese)

[6] 王丁棉.牧草飼料是奶牛業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ).北京:中國苜蓿發(fā)展大會暨牧草種子、機(jī)械、產(chǎn)品展示會,2003.

Wang D M.Forage Grass is the Basis for Dairy Industry Development.Proccedings of China Alfalfa Development Conference and Forage Seeds,Machinery,Products Exhibition.Beijing:China Animal Agriculture Association,2003.(in Chinese)

[7] 顧洪如,陳禮偉.牧草飼料作物在發(fā)展節(jié)糧型養(yǎng)殖業(yè)中的地位與作用.草業(yè)科學(xué),1993(3):47-49.

Gu H R,Chen L W.The Status and function of forage crops in the development of grain farming industry.Pratacultural Science,1993(3):47-49.(in Chinese)

[8] 艾丹,郭春華,徐亞歐,楊虎林,黃艷玲,嚴(yán)錦繡,于婷婷.四川阿壩縣不同地區(qū)與不同海拔秋季牧草營養(yǎng)成分分析.草業(yè)科學(xué),2011,28(8):1529-1532.

Ai D,Guo C H,Xu Y O,Yang H L,Huang Y L,Yan J X,Yu T T.Analysis on the nutritional components of autumn forage in different areas and different altitudes of Aba County, Sichuan Province.Pratacultural Science,2011,28 (8):1529-1532.(in Chinese)

[9] 李鴻祥.優(yōu)質(zhì)牧草對奶牛多產(chǎn)奶的作用.中國畜牧業(yè),2004(23):66-69.

Li H X.Effects of high quality forage on milk production of dairy cattle.China Animal Industry,2004(23):66-69.(in Chinese)

[10] Wang R Q,Liu R J,Chang M,Jin Q Z,Liu Y F,Wang X G.A review of the physical detoxification of aflatoxins in cereal and oilseeds products.Cereal & Feed Industry,2013(7):56-59.

[11] Tang J Q,Pang G C.Application of immunosensors to detection of aflatoxin in foods:A review.Food Science,2009,30(17):326-329.

[12] Delmulle B S,de Saeger S M,Sibanda L,Bama-Vetro I,Peteghem C H V.Development of an immunoassay-based lateral flow dipstick for the rapid detection of aflatoxin B1in pig feed.Journal of Agricultural & Food Chemistry,2005,53(9):3364.

[13] Moss M O.Recent studies of mycotoxins.Symposium,1998,27(S1):62S-76S.

[14] Arjmandtalab S.Effect of production and storage of probiotic yogurt on aflatoxin M1residue.Journal of Food Quality and Hazards Control,2014,1(1):7-14.

[15] Sumantri I,Murti T W,Poel A F B V D,Boehm J,Agus A.Carry-over of aflatoxin B1-feed into aflatoxin M1-milk in dairy cows treated with natural sources of aflatoxin and bentonite.Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture,2012,37(4):271-277.

[16] 程廣龍,楊永新,趙輝玲,陳勝,江喜春.黃曲霉毒素對奶牛生產(chǎn)的危害及其控制措施.中國草食動物科學(xué),2012,32(3):79-81.

Cheng G L,Yang Y X,Chen S,Jiang X C.The harm of aflatoxins to the production of dairy cows and control measures.China Herbivore Science,2012,32(3):79-81.(in Chinese)

[17] 羅小虎,王韌,王莉,李永富,沈利楊,王勇,陳正行.高效液相色譜快速測定玉米中黃曲霉毒素的研究.中國糧油學(xué)報,2014,29(6):99-103.

Luo X H,Wang R,Wang L,Li Y F,Shen L Y,Wang Y,Chen Z X.Rapid detection of aflatoxins in corns by high performance liquid chromatography.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2014,29(6):99-103.(in Chinese)

[18] 付春麗,劉文靜,高騰云.霉菌毒素對奶牛的影響及其控制措施.草業(yè)科學(xué),2015,32(9):1500-1507.

Fu C L,Liu W J,Gao T Y.Mycotoxin effects on dairy cows and control measures.Pratacultural Science,2015,32(9):1500-1507.(in Chinese)

[19] Henry S H,Bosch F X,Bowers J C.Aflatoxin,hepatitis and worldwide liver cancer risks.Advances in Experimental Medicine & Biology,2002,504(48):229-33.

[20] 肖傳英,馮廣鵬,魏金濤,鄭金玉.飼料中黃曲霉毒素研究進(jìn)展.畜禽業(yè),2007(5):4-7.

Xiao C Y,Feng G P,Wei J T,Zheng J Y.A review:A aflatoxins in feed.Livestock and Poultry Industry,2007(5):4-7.(in Chinese)

[21] IARC.IARC monograph on the evaluation of carcinogenic risk to humans,some naturally occurring substances:Food items and constituents,heteroyclic aromatic amines and mycotoxins.Lyon,France:The International Agency for Research on Cancer,1993:56.

[22] IARC.IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.Some traditional herbal medicines,some mycotoxins,naphthalene and styrene.Lyon,France:Iarc Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans,2002:1-556.

[23] Tantikitti C.Feed palatability and the alternative protein sources in shrimp feed.Songklanakarin Journal of Science & Technology,2014,36(1):51-55.

[24] 劉紹偉,羅仕歡.影響飼料適口性的主要因素及改善措施.飼料與畜牧:新飼料,2014,36(1):51-55.

Liu S W,Luo S H.The main factors affecting palatability of feed and the improvement measures.Feed and Animal Husbandry:New Feed,2014,36(1):51-55.(in Chinese)

[25] 姚勤,黃章根.霉菌對飼料的污染及防治.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2006(4):76-77.

Yao Q,Huang Z G.Contamination and Control of Mold in feed.Agriculture Science and Technology,2006(4):76-77.(in Chinese)

[26] Bartov I,Paster N,Lisker N.The nutritional value of moldy grains for broiler chicks.Poultry Science,1982,61(11):2247.

[27] 陽成波,黃鐵軍.不同飼料防霉劑防霉效果的比較及其影響因素.廣東飼料,2012(12):23-25.

Yang C B,Huang T. Comparison of different factors and the influence of feed preservative effect.Guangdong Feed,2012(12):23-25.(in Chinese)

[28] 楊加豹.動物飼料適口性與影響因素.飼料研究,2001,1(1):23-26.

Yang J B.Palatability of animal feed and influencing factors.Feed Research,2001,1(1):23-26.(in Chinese)

[29] Shi D,Liao S,Su R,Chen Y,Wu H,Tang Z X,Guo S N.Effects of Long Dan Xie Gan on hepatic antioxidant capacity in ducklings with aflatoxin B1toxicity.American Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine,2013,8(1):31.

[30] Mehrzad J,Devriendt B,Baert K,Cox E.Aflatoxin B1interferes with the antigen-presenting capacity of porcine dendritic cells.Toxicology in Vitro,2014,28(4):531-537.

[31] Shi D Y,Guo S N,Liao S Q,Su R S,Pan J Q,Lin Y C,Tang Z X.Influence of selenium on hepatic mitochondrial antioxidant capacity in ducklings intoxicated with aflatoxin B1.Biological Trace Element Research,2012,145(3):325.

[32] Kabak B,Dobson A D,Var I.Strategies to prevent mycotoxin contamination of food and animal feed:A review.Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2006,46(8):593-619.

[33] 鄧運(yùn)清.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).中國飼料,2001(21):24-27.

Deng Y Q.Hygienical standard for feed in China.China Feed,2001(21):24-27.(in Chinese)

[34] Wu Y N.GB2761-2011.China National Food Safety Standard:Maximum Limit of Mycotoxins in Food.Beijing:China Standard Press,2011.

[35] Siloto E V,Oliveira E F,Sartori J R,Fascina V B,Martins,B A,Ledoux D R,Rottinghaus G E,Sartori D R.Lipid metabolism of commercial layers fed diets containing aflatoxin,fumonisin,and a binder.Poultry Science,2013,92(8):2077-2083.

[36] Fetaih H A,Dessouki A A,Hassanin A A,Tahan A S.Toxopathological and cytogenetic effects of aflatoxin B1(AFB1) on pregnant rats.Pathology Research & Practice,2014,210(12):1079-1089.

[37] Rustemeyer S M,Lamberson W R,Ledoux D R,Wells K,Austin K J.Effects of dietary aflatoxin on the hepatic expression of apoptosis genes in growing barrows.Journal of Animal Science,2011,89(4):916-925.

[38] 車玉媛,曹有才.一起奶牛霉菌毒素慢性中毒的診斷和治療.現(xiàn)代畜牧科技,2014(4):207.

Che Y Y,Cao Y C.The diagnosis and treatment of chronic poisoning caused by mycotoxins in dairy cows.Technical Advisor for Animal Husbandry,2014(4):207-207.(in Chinese)

[39] Supriya C,Girish B P,Reddy P S.Aflatoxin B1-induced reproductive toxicity in male rats:Possible mechanism of action.International Journal of Toxicology,2014,33(3):155-161.

[40] Mehrzad J,Klein G,Kamphues J,Wolf P,Grabowski N,Schuberth H J.In vitro effects of very low levels of aflatoxin B1on free radicals production and bactericidal activity of bovine blood neutrophils.Veterinary Immunology & Immunopathology,2011,141(1-2):16-25.

[41] 李瑞娟,巴翠晶,段雪磊,閆靜姣,康佳,史萬玉.不同濃度黃曲霉毒素B1對雛雞血液生理指標(biāo)的影響.中國家禽,2014,36(13):37-40.

Li R J,Ba C J,Duan X L,Yan J J,Kang J,Shi W Y.Effects of different concentration of aflatoxin B1on hematopoietic functions in chicken.China Poultry,2014,36(13):37-40.(in Chinese)

[42] Moschini M,Masoero F,Gallo A,Diaz D.Mucosal absorption of aflatoxin B1in lactating dairy cows.Italian Journal of Animal Science,2010,6(1):324-326.

[43] Diaz D E,Hagler W M,Blackwelder J T,Eve J A,Hopkins B A,Anderson K L,Jones F T,Whitlow L W.Aflatoxin binders Ⅱ:Reduction of aflatoxin M1in milk by sequestering agents of cows consuming aflatoxin in feed.Mycopathologia,2004,157(2):233-41.

[44] Battacone G.Excretion of aflatoxin M1in milk of dairy ewes treated with different doses of aflatoxin B1.Journal of Dairy Science,2003,86(8):2667-2675.

[45] Rama A,Montesissa C,Lucatello L,Galina G,Benetti C,Bajraktari D.A study on the occurrence of aflatoxin M1in milk consumed in Kosovo during 2009-2010.Food Control,2016,62:52-55.

[46] Chavarría G,Granadoschinchilla F,Alfarocascante M,Molina A.Detection of aflatoxin M1in milk,cheese and sour cream samples from Costa Rica using enzyme-assisted extraction and HPLC.Food Additives & Contaminants Part B Surveillance,2015,8(2):128.

[47] Han R W,Zheng N,Wang J Q,Zhen Y P,Xu X M,Li S L.Survey of aflatoxin in dairy cow feed and raw milk in China.Food Control,2013,34(1):35-39.

[48] 馬濤.黃曲霉素分析方法簡介與比較.科學(xué)之友,2007(2):148-148.

Ma T.Introduction and comparison of methods for aflatoxin analysis.Friends of Science Amateurs,2007(2):148-148.(in Chinese)

[49] Bellio A,Bianchi D M,Gramaglia M,Loria A,Nucera D,Gallina S,Gili M,Decastelli L.Aflatoxin M1in cow’s milk:Method validation for milk sampled in northern Italy.Toxins,2016,8(3):57.

[50] 屈俊成,張昕,張峰,成林林,張慧利.免疫親和柱凈化-高效液相法測定飼料中黃曲霉毒素.當(dāng)代畜牧,2016(10):51-52.

Qu J C,Zhang X,Zhang F,Cheng L L,Zhang H L.Determination of aflatoxins in feed by immunoaffinity column purification and high performance liquid chromatography.Contemporary Animal Husbandry,2016(10):51-52.(in Chinese)

[51] 趙曉聯(lián),龔燕,孫秀蘭,孫蔚榕,趙春城.金標(biāo)免疫層析法檢測黃曲霉毒素B1的方法.糧油食品科技,2005,13(6):49-51.

Zhao X L,Gong Y,Sun X L,Sun W R,Zhao C C.Study on the methodology of gold labeled immunochromatographic stip assay for detection of AFB1in food.Science and Technology of Cereals，Oils and Foods,2005,13(6):49-51.(in Chinese)

[52] 白曉玲.抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備及鑒定.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009.

Bai X L.Preparation and identification of monoclonal antibodies for aflatoxin B1.Master Thesis.Huhhot:Inner Mongolia Agricultural University,2009.(in Chinese)

[53] 王偉，葛寶坤，周榮，劉烜，蘇毅，趙良娟，王志英.免疫親和-熒光光度法快速測定乳脂及其制品中的黃曲霉毒素M1.口岸衛(wèi)生控制，2006,11(4)：24-25.

Wang W,Ge B K,Zhou R,Liu X,Su Y,Zhao L J,Wang Z Y.The fast determination of aflatioxin M1in milk grease and its products with immunity affinity and fluorescence photometric method.Port Health Control,2006,11(4):24-25.(in Chinese)

[54] Omar S S.Aflatoxin M1levels in raw milk,pasteurised milk and infant formula.Italian Journal of Food Safety,2016,5(3):158-160.

[55] 周潔.環(huán)境毒物及癌癥標(biāo)志物檢測的新型電化學(xué)生物傳感器研究.杭州:浙江大學(xué)博士學(xué)位論文,2015.

Zhou J.Studies on a novel electrochemical biosensor and its application on the detetion of environmental poison and 1ancer biomarker.PhD Thesis.Hangzhou:Zhejiang University,2015.(in Chinese)

[56] Liu D L.The assembly of a novel enzyme biosensor for aflatoxin B1Detection.China Biotechnology,2008,28(3):44-52.

[57] 杜祎,李敬龍,畢春元.生物傳感器法測定花生中黃曲霉毒素B1.食品科技,2015(8):310-313.

Du Y,Li J L,Bi C Y.Determination of aflatoxin in peanuts by biosensor.Food Science and Technology,2015(8):310-313.(in Chinese)

[58] Parker C O,Tothill I E.Development of an electrochemical immunosensor for aflatoxin M1in milk with focus on matrix interference.Biosensors & Bioelectronics,2009,24(8):2452-2457.

[59] Daly S J,Keating G J,Dillon P P,Manning B M,Kennedy R,Lee H A,Morgan M R.Development of surface plasmon resonance:Based immunoassay for aflatoxin B1.Journal of Agricultural & Food Chemistry,2000,48(11):5097-5104.

[60] Arroyomanzanares N,Gámizgracia L,Garcíacampaa A M,Garcia-Ayuso L E.On-line preconcentration for the determination of aflatoxins in rice samples by micellar electrokinetic capillary chromatography with laser-induced fluorescence detection.Electrophoresis,2010,31(13):2180-2185.

[61] 程傳民,李云,周朝華,柏凡,王宇萍,林順全,廖峰.2014年黃曲霉毒素在飼料產(chǎn)品中的污染分布規(guī)律.糧食與飼料工業(yè),2016,12(2):42-45.

Cheng C M,Li Y,Zhou Z H,Bai F,Wang Y P,Lin S Q,Liao F.Distribution laws of aflatoxin B1contamination in feedstuffs in 2014.Cereal and Feed Industry,2016,12(2):42-45.(in Chinese)

[62] 琚澤亮,趙桂琴,覃方銼,焦婷.含水量對燕麥及燕麥+箭筈豌豆裹包青貯品質(zhì)的影響.草業(yè)科學(xué),2016,33(7):1426-1433.

Ju Z L,Zhao G Q,Qin F C,Jiao T.Effect of different moisture contents on fermentation quality of baling silage of monoculture oat and common vetch mixture.Pratacultural Science,2016,33(7):1426-1433.

[63] Sharma A,Sharma K.Protection of maize by storage fungi and aflatoxin production using botanicals.Indian Journal of Natural Products & Resources,2012,3(2):215-221.

[64] Lyn M,Abbas H K,Zablotowicz R.Water dispersible formulation for delivery of biocontrol fungi to reduce aflatoxin.United States Patent,9011981.2015-04-21.

[65] 周志生.帶溫控裝置的飼料制備系統(tǒng):中國,CN203872969U[P].(2014-04-22)(2016-10-25).

Zhou Z S.A Feed Preparation System with a Temperature Control Device China Patent.CN203872969U.(2014-04-22)(2016-10-25). (in Chinese)

[66] Zhou J,Huang R,Huang J,Feng J.Anti-inflammation activities of essential oil and anti-microbial activities of ethanol extraction from China’s rosemary.Agricultural Science & Technology,2015(5):1034-1037.

[67] 盧智文.飼料的低溫貯藏.中國飼料,1998(4):41.

Lu Z W.Low temperature storage of feed.China Feed,1998 (4):41-41.

[68] 聶繼軍.豬玉米霉菌毒素中毒的綜合防治方案.中國畜禽種業(yè),2015,11(4):91-92.

Nie J J.A Comprehensible control program of swine for corn mycotoxin poisoning.Chinese Livestock and Poultry Breeding,2015,11 (4):91-92.(in Chinese)

[69] Markov S A.Mold spores.United States:Encyclopedia of Global Warming，2009.

[70] Tets V V,Tets G V,Krutikov V I.Fungicide.United States Patent,2650285 A4.2005-09-20.

[71] Komolprasert V.Packaging food for radiation processing.Radiation Physics & Chemistry,2016,129:35-38.

[72] Chen C D,Tao J,Liu D.The research progress of feed irradiation.Feed Review,2011(4):13-15.

[73] Bryden W L.Mycotoxin contamination of the feed supply chain:Implications for animal productivity and feed security.Animal Feed Science & Technology,2012,173(1-2):134-158.