鮑溫病及佩吉特病患者皮損中GRIM 19表達(dá)水平的研究*

劉隨 劉斌 金汶 徐倩倩(湖北省藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院皮膚科, 湖北 隨州 441300)

鮑溫病是一種常見的原位皮膚鱗狀細(xì)胞癌, 常發(fā)生于老年人, 臨床上主要表現(xiàn)為皮膚表面出現(xiàn)邊緣不規(guī)則的褐色斑塊, 斑塊上方會(huì)有少量的鱗屑, 其發(fā)病原因有與長期暴露在紫外線、接觸某些化學(xué)試劑(如砷)、人類乳頭狀病毒的感染以及某些疾病(如著色干皮病、疣狀角化不良病)有關(guān), 目前手術(shù)切除是治療鮑溫病的最有效治療方式[1-3]。佩吉特病分為乳腺佩吉特病和乳腺外佩吉特病, 該病具有易轉(zhuǎn)移浸潤, 易引發(fā)乳腺癌，乳腺外佩吉特病易引發(fā)泌尿生殖道或消化道癌、病程長等特點(diǎn)；手術(shù)切除是該病早期的主要治療方式[4-5]。盡管鮑溫病和佩吉特病在臨床上困擾患者多年, 但是它們的發(fā)病具體機(jī)制尚不清楚。干擾素與維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 19(GRIM 19)是一種與腫瘤細(xì)胞的生長有關(guān)的抑癌基因, 其能夠參與調(diào)控癌細(xì)胞的遷移、浸潤及生長, 近些年成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[6-7]。此外, 研究發(fā)現(xiàn)GRIM 19在部分癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下降[8]。GRIM 19與鮑溫病和佩吉特病之間是否有關(guān)系尚不得知, 本研究通過檢測(cè)鮑溫病和佩吉特病患者皮損部位GRIM 19水平, 探究GRIM 19與鮑溫病和佩吉特病之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2015年7月～2016年7我院診療的鮑溫病和佩吉特病患者共70例。其中鮑溫病患者37例, 其中男性14例, 女性23例, 平均年齡(57.1±8.9)歲, 患者患病區(qū)域分別在四肢(上肢患病13例, 男性4例, 女性9例；下肢患病12例, 男性4例, 女性8例)和軀干(12例, 男性6例, 女性6例)；佩吉特病患者33例, 其中男性8例, 女性25例, 平均年齡(59.1±9.7)歲, 其中乳腺佩吉特病17例(患病位置均是乳房區(qū)域, 患者均為女性), 乳腺外佩吉特病16例(患病區(qū)域在腋窩5例, 男性2例, 女性3例；患病區(qū)域在腹股溝6例, 其中男性3例, 女性3例；患病區(qū)域在外耳道5例, 其中男性3例, 女性2例)。健康正常人34例, 其中男性13例, 女性21例, 平均年齡(58.7±8.3)歲, 均自愿參與該研究。鮑溫病患者的年齡、性別和佩吉特病患者的年齡、性別分別與健康正常人的年齡、性別之間無顯著性差異。納入標(biāo)準(zhǔn): ①符合鮑溫病和佩吉特病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。②血常規(guī)、肝、腎功能正常。③自愿接受樣本采集。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合本病診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者。②接受過化療的患者。③癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 鮑溫病和佩吉特病患者皮損組織樣本由本科室臨床醫(yī)生采集, 采集后的皮損組織部分置于4%多聚甲醛固定, 用于免疫組化檢測(cè), 剩余部分皮損組織置于液氮保存, 用于Real-time PCR檢測(cè)。根據(jù)患者的患病區(qū)域, 在本單位皮膚整形科室盡可能收集與每個(gè)患者患病區(qū)域?qū)?yīng)的健康人皮膚組織(通過檢測(cè)收集到不同部位健康皮膚組織中的GRIM 19表達(dá)水平, 我們發(fā)現(xiàn)皮膚組織GRIM 19表達(dá)水平無顯著的區(qū)域差異性), 這些皮膚組織部分置于4%多聚甲醛固定, 用于免疫組化檢測(cè), 剩余部分皮膚組織置于液氮保存, 用于Real-time PCR檢測(cè)。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè) 將健康皮膚及皮損組織研磨, 應(yīng)用Trizol法提取皮膚組織的總RNA, 以總RNA為模板, Oligo(dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 選用在皮膚組織中穩(wěn)定表達(dá)的β-actin 作為內(nèi)參, 應(yīng)用Real-time PCR 測(cè)定健康皮膚及皮損組織GRIM 19 mRNA表達(dá)水平, GRIM 19上游引物: 5'-CACGGATCGTCCACAGCCC-3', 下游引物: 5'-TCAGGACAATCGTGGACAC-3'；β-actin上游引物: 5'-ACATCTGCTGAAGGTGGAC-3', 下游引物: 5'-GGTACCACCATACCAGG-3'。

1.2.3 免疫組化 取4%多聚甲醛固定的健康皮膚組織及皮損組織, 經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)步驟后, 與兔抗人GRIM 19抗體(購于CST公司)在37℃下孵育1 h, TBS洗滌3次后, 與羊抗兔抗體于37℃下孵育1 h, TBS洗滌3次后, 采用DAB顯色, 在顯微鏡下拍攝結(jié)果, 被染成黃色或棕黃色者為陽性。并采用圖像分析軟件ImagePro Plus分析各樣本陽性表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 鮑溫病及佩吉特病患者皮損組織GRIM 19 mRNA表達(dá)水平的變化 Real-time PCR結(jié)果表明, 鮑溫病與佩吉特病患者皮損組織中GRIM 19 mRNA表達(dá)水平相比于健康人皮膚組織, 顯著下降(P<0.05), 見圖1。

圖1鮑溫病及佩吉特病皮損組織GRIM19mRNA表達(dá)水平與健康人皮膚組織對(duì)比

Figure1GRIM19mRNAexpressionsofkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandPaget'sdiseaseandhealthypeople

注: A: 鮑溫病VS健康人①P<0.05；B: 佩吉特病VS健康人, ②P<0.01

2.2 鮑溫病及佩吉特病患者皮損組織GRIM 19 蛋白表達(dá)水平的變化 免疫組化結(jié)果表明, 鮑溫病及佩吉特病患者皮損組織中GRIM 19 蛋白表達(dá)水平相比于健康人皮膚組織顯著下降, 結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

圖2鮑溫病及佩吉特病皮損組織GRIM19蛋白表達(dá)水平與健康人皮膚組織對(duì)比

Figure2GRIM19proteinexpressionsofkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandPaget'sdiseaseandhealthypeople

注: A: 鮑溫病VS健康人, ①P<0.05；B: 佩吉特病VS健康人, ②P<0.01

圖3鮑溫病患者皮損組織及健康人皮膚組織中GRIM19免疫組化結(jié)果
Figure3TheimmunohistochemicalresultsofGRIM19inkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandhealthypeople

圖4 佩吉特病患者皮損組織及健康人相應(yīng)皮膚組織中GRIM 19免疫組化結(jié)果Figure 4 The immunohistochemical results of GRIM 19 in kin lesion of patients with Paget's disease and healthy people

3 討論

GRIM 19最早是由美國馬里蘭州大學(xué)腫瘤中心研究人員于2000年發(fā)現(xiàn), 主要存在于線粒體內(nèi)膜上, 能夠參與構(gòu)成線粒體復(fù)合體I[9]。隨著研究深入, GRIM 19近年被公認(rèn)為一種抑癌基因[10]。GRIM 19誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制比較復(fù)雜, 但研究表明其發(fā)揮功能主要是通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)呼吸鏈。復(fù)合體I是線粒體內(nèi)主要呼吸鏈的重要組成成分, 而GRIM 19是復(fù)合體I的功能單位, 其通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的呼吸鏈活動(dòng), 進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的能量產(chǎn)生, 當(dāng)細(xì)胞生長異常時(shí), GRIM 19通過抑制細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈呼吸強(qiáng)度, 進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[8, 11]。除了通過調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸鏈調(diào)節(jié)細(xì)胞生存狀態(tài), 研究還發(fā)現(xiàn)GRIM 19可以通過調(diào)節(jié)STAT3, 進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[12-13]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 當(dāng)癌細(xì)胞表達(dá)的GRIM 19水平升高后, GRIM 19結(jié)合的STAT3含量也相應(yīng)增多, 而癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移能力受到顯著的抑制[14]。

GRIM 19在人體組織器官中普遍表達(dá), 且在心臟及骨骼肌中表達(dá)量較高[15]。但是研究發(fā)現(xiàn), GRIM 19在肺癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及甲狀腺Hurthle細(xì)胞腫瘤組織中表達(dá)水平顯著下降, 且GRIM 19表達(dá)水平與肺癌的臨床分期呈負(fù)相關(guān)；GRIM 19在肝癌及乳腺癌細(xì)胞中的水平與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤能力有關(guān)；GRIM 19在宮頸癌、食管癌、前列腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞中的水平與腫瘤的惡性程度以及預(yù)后有關(guān)系[15-17]。因此, 通過研究腫瘤GRIM 19有利于腫瘤細(xì)胞的診斷分型、預(yù)后等, 且GRIM 19能夠作為治療這些腫瘤的新靶點(diǎn)。鮑溫病及佩吉特病是常見的皮膚腫瘤疾病, 手術(shù)時(shí)治療該類疾病的主要方式, 目前關(guān)于鮑溫病及佩吉特病發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)的研究尚不足。本研究發(fā)現(xiàn), 健康人皮膚組織表皮基底層細(xì)胞高表達(dá)GRIM 19, 而鮑溫病及佩吉特病患者皮損癌組織中GRIM 19表達(dá)水平顯著低于健康人皮膚組織水平。而GRIM 19作為一個(gè)細(xì)胞凋亡調(diào)控因子, 可特異性地與信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)結(jié)合, 阻斷細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核, 通過下調(diào)STAT3的轉(zhuǎn)錄激活活性, 抑制其靶基因的表達(dá), 繼而控制細(xì)胞的生長[18-19]。故鮑溫病及佩吉特病的發(fā)生、發(fā)展可能干擾了GRIM 19的正常表達(dá), 致使該因子對(duì)細(xì)胞生長的調(diào)控作用失效, 最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖的發(fā)生。而GRIM 19是否是鮑溫病及佩吉特病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去確定。

4 結(jié)論

本文資料顯示，GRIM 19與鮑溫病及佩吉特病存在相關(guān)性, 提示GRIM 19可能在鮑溫病及佩吉特病發(fā)病過程中扮演重要角色, 為鮑溫病及佩吉特病臨床診斷分型及發(fā)病機(jī)制的研究提供了理論基礎(chǔ)。

[1]禚欣欣, 康定華, 徐春興.鮑溫病66例臨床分析[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志, 2013, 29(3): 219-220.

[2]胡志國, 陳艷, 匡亞玲, 等.CCL27、CCR10在鮑溫病患者皮損中的表達(dá)[J].皮膚性病診療學(xué)雜志, 2013, 20(2): 97-100.

[3]胡于良, 熊霞.鮑溫病的臨床治療進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)信息, 2014(3): 487-487.

[4]邵牧民, 孟剛.乳腺及乳腺外佩吉特病研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志, 2004, 24(6): 495-497.

[5]Calvillo K Z, Guo L, Brostrom V,etal.Recurrence of breast carcinoma as Paget disease of the skin at a prior core needle biopsy site: Case report and review of the literature[J].International journal of surgery case reports, 2015, 15: 152-156.

[6]何興鴻, 賀敏, 郝莎.維甲酸-干擾素聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因-19表達(dá)作為結(jié)直腸癌預(yù)后新型標(biāo)志物的可行性探討[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 15(16): 1594-1598

[7]Zhou Y, Xu F, Tao F,etal.GRIM-19 restores cervical cancer cell senescence by repressing hTERT transcription[J].Journal of Interferon & Cytokine Research, 2016, 36(8): 506-515.

[8]Zhang X Y, Li M, Sun K,etal. Decreased expression of GRIM-19 by DNA hypermethylation promotes aerobic glycolysis and cell proliferation in head and neck squamous cell carcinoma[J].Oncotarget, 2015, 6(1): 101.

[9]崔文娟, 鄧曉惠, 晁嵐, 等.GRIM-19在小鼠植入前胚胎中的表達(dá)及其作用[J].解剖學(xué)報(bào), 2013, 44(1): 97-101.

[10] Kalakonda S, Nallar S C, Jaber S,etal.Monoallelic loss of tumor suppressor GRIM-19 promotes tumorigenesis in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013, 110(45): 4213-4222.

[11] Siegel R, Naishadham D, Jemal A.Cancer statistics, 2013[J].CA: a cancer journal for clinicians, 2013, 63(1): 11-30.

[12] 李永光, 朱偉, 魏盟.GRIM-19與STAT3蛋白作用及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志, 2013, 42(9): 157-159.

[13] Nallar S C, Kalakonda S, Lindner D J,etal.Tumor-derived mutations in the gene associated with retinoid interferon-induced mortality (GRIM-19) disrupt its anti-signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) activity and promote oncogenesis[J].Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(11): 7930-7941.

[14] Li Y G, Xia H J, Tao J P,etal. GRIM19mediated Stat3 activation is a determinant for resveratrolinduced proliferation and cytotoxicity in cervical tumorderived cell lines[J].Molecular medicine reports, 2015, 11(2): 1272-1277.

[15] 趙禎, 沈國華, 蔡華偉.細(xì)胞凋亡基因GRIM-19研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué), 2016, 45(14): 1984-1986.

[16] Chen Y, Lu H, Liu Q,etal.Function of GRIM-19, a mitochondrial respiratory chain complex I protein, in innate immunity[J].Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(32): 27227-27235.

[17] 吳棪, 陳喬爾.腫瘤免疫逃逸的相關(guān)分子及其作用機(jī)制研究[J].安徽醫(yī)藥, 2016, 20(4): 621-625.

[18] Yu H, Lee H, Herrmann A,etal.Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions[J].Nature Reviews Cancer, 2014, 14(11): 736-746.

[19] Nguyen A V, Wu Y Y, Liu Q,etal.STAT3 in epithelial cells regulates inflammation and tumor progression to malignant state in colon[J].Neoplasia, 2013, 15(9): 998-1008.