高原低氧環(huán)境與大鼠SAP肝損傷中TNF-α的相關(guān)性*

潘洪帥 郭亞民 朱海宏(青海省人民醫(yī)院普外科，青海 西寧 810000)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis, SAP)病情復(fù)雜兇險，其發(fā)病機制至今尚未完全闡明，研究表明，肝臟是最早也是最易受到損傷的器官之一。SAP引起的肝功能損害主要是引起ALT、AST的升高。通過此項目我們能對高原環(huán)境下SAP的發(fā)生和發(fā)展進行完善的總結(jié)以及指導(dǎo)治療。

隨著對SAP病理機制研究的不斷深入，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在SAP中的作用也越來越備受科學(xué)家的關(guān)注。TNF-α也可由肝臟生成，其能加劇對肝細胞的各種損傷作用[1]。機體的免疫平衡會被TNF-α所破壞[2]。由肝巨噬細胞分泌的TNF-α本身也可以誘導(dǎo)激發(fā)其他炎癥因子的生成，引起肝細胞破壞、肝小葉受損，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高[3]。TNF-α可分泌多種趨化因子，對白細胞粘附起誘導(dǎo)作用，從而引發(fā)炎癥，對肝臟的損傷最為嚴重[4]，研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)機體的TNF-α在SAP的急性反應(yīng)期的分泌量可以對患者病情的嚴重程度作出判斷、對疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸作出預(yù)測[5-7]。同時表明SAP肝損害與TNF-α有著密不可分的聯(lián)系。因目前罕見關(guān)于低氧環(huán)境下重癥急性胰腺炎肝損害與TNF-α的相關(guān)性研究，本實驗對高原地區(qū)胰腺炎患者的治療提供了新思維和新視野。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 以200只SPF級雄性Wistar大鼠為實驗對象，平均體重145g，以上大鼠由西安交通大學(xué)實驗動物中心購買。

1.2 主要材料與儀器 ①試劑：蘇木素-伊紅(HE)染色試劑(青海省人民醫(yī)院病理科)、TNF-α免疫組化試劑盒(博士德生物有限公司)、DAB顯色劑(博士德生物有限公司)、?；悄懰徕c(Na-Tc)(美國Sigma公司)、22%烏拉坦(青海省人民醫(yī)院病理科)、4%PBS、3%H2O2、蒸餾水、10%福爾馬林液等。②儀器：電熱恒溫水浴箱(北京長安科學(xué)儀器廠)、全自動生化分析儀(日本Sysmex株式會社)、4℃低溫冰箱(青島海爾集團)、-70℃低溫冰箱(青島海爾集團)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器廠)、離心機(北京東方儀器廠)、組織包埋機(德國LEICA公司)、輪轉(zhuǎn)切片機(德國LEICA公司)、顯微成像系統(tǒng)(尼康公司)、液氮罐(河南新亞低溫容器有限公司)、光學(xué)顯微鏡(歐利普斯公司)、Excelsior ES自動組織脫水機(ThermoScientific公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及分組情況 以200只SPF級雄性Wistar大鼠為實驗對象(西安交通大學(xué)實驗動物中心購買)，將統(tǒng)一購買的大鼠隨機分為四個大組，分別送往平原地區(qū)(西安)、2000米海拔(西寧)、3000米海拔(興海)、4000米海拔(溫泉)四個地區(qū)，均在當(dāng)?shù)亓?xí)服20天。每個地區(qū)的大鼠又隨機劃分成假手術(shù)、1、6、12、24h組五個小組。派往各地區(qū)的實驗人員進行統(tǒng)一培訓(xùn)，使各地區(qū)手術(shù)方法及手術(shù)步驟統(tǒng)一，使用統(tǒng)一的手術(shù)器材及實驗器材，執(zhí)行統(tǒng)一的造模標準。于下腹正中部注入22%烏拉坦，注入量按體重計算，每千克體重注4ml。大鼠活動力明顯下降后，把大鼠平臥，四肢捆綁至鼠板臺的鋼釘，碘伏棉棒擦拭上腹正中部。進腹后，找到胰腺后，按1ml/kg計算注射量后，將5%牛黃膽酸鈉(Natrii Tauroglycocholas, Na-Tc)分別在胰尾部、胰體部以及胰頭部的胰腺被膜下緩慢注射進行造模，造模成功后縫合關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組進入腹腔找到胰腺后僅對胰腺組織翻動觸摸數(shù)次后就進行關(guān)閉腹腔。成功造模后分組擱置，清醒后的大鼠均可自由飲水。調(diào)整各海拔、各時間組的環(huán)境溫度相一致。

假手術(shù)組統(tǒng)一約定在關(guān)腹后6 h處死，其他各時間段分別在造模后第1、6、12、24h 4個時間點注射22%烏拉坦(4ml/kg)進行麻醉，對麻醉后的大鼠進行采血和解剖取肝臟組織和胰腺組織，首先，找到腹主動脈后用1ml注射器采血1ml，放置于封閉抗凝采血管。離心(3000轉(zhuǎn)/min)15min處理，收集大鼠血清(測定肝功指標)。然后觀察胰腺組織和肝臟組織的病理變化，取肝臟組織和胰腺組織，并放入盛有10%福爾馬林溶液的小瓶后分組別標記清楚后保存。

1.3.2 檢測指標 離心血清檢測ALT、AST濃度；應(yīng)用免疫組化方法對肝臟TNF-α進行高通量相關(guān)性研究。對肝細胞功能受損指標(AST、ALT)行含量檢測和資料研究，用Image-Pro Plus 6.0計算肝免疫組化的OD值。 由兩位病理醫(yī)師高倍鏡下隨機取4個視野統(tǒng)計胰腺病理評分，見表1。

2 結(jié)果

2.1 胰腺病理變化 假手術(shù)組各海拔的病變基本一致，同正常組織差別很??；各地區(qū)分組的大鼠胰腺組織的病理評分均隨時間的延長而加重。除假手術(shù)組外，同一時間段內(nèi)，大鼠胰腺組織的病損程度隨海拔增高而加重，見圖1。

2.2 血淀粉酶變化 同海拔組內(nèi)，大鼠血淀粉酶隨時間延長而增加，與時間變化成正比，組內(nèi)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時間組內(nèi)，假手術(shù)組血淀粉酶的變化與海拔變化的關(guān)系不大，組內(nèi)兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余1h組、6h組、12h組、24h組血淀粉酶的變化均隨海拔的增高而增加，與海拔變化成正相關(guān),組內(nèi)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 不同海拔不同時間大鼠胰腺病理評分的變化Figure 1 Pathological grading of pancreas in rats at different altitude and time

圖2 大鼠血淀粉酶在不同海拔不同時間的變化Figure 2 Changes of serum amylase in rats at different altitudes and times

2.3 ALT、AST變化 同海拔組內(nèi)，大鼠ALT、AST隨時間延長而增加，與時間變化成正比，組內(nèi)兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時間組內(nèi)， 1h組、6h組、12h組、24h組ALT、AST的變化均隨海拔的增高而增加，組內(nèi)兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與海拔變化成正相關(guān)，假手術(shù)組ALT、AST的變化與海拔變化關(guān)系不大，見圖3、圖4。

2.4 TNF-α與海拔時間的變化 同海拔組內(nèi)，TNF-α的表達均隨時間的延長而延長，組內(nèi)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時間組內(nèi)，假手術(shù)組TNF-α的的表達不隨時間增加而增加， 1h組、6h組、12h組、24h組的TNF-α的表達隨海拔的增加而增加，組內(nèi)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖3 不同海拔不同時間大鼠ALT的變化Figure 3 Changes of ALT in rats at different altitudes and different times

圖4 不同海拔不同時間大鼠AST的變化Figure 4 Changes of AST in rats at different altitudes and different times

圖5 不同海拔不同時間大鼠TNF-α OD值的變化Figure 5 Changes in different altitudes and different time of TNF-rat alpha OD

3 討論

重癥急性胰腺炎(SAP)引起其他器官損傷是困擾治療的常見問題，TNF-α在SAP引起肝臟損害中起重要作用。Duarte等提出了“白細胞過度激活”學(xué)說機制[9-11]，他們研究表明白細胞釋放的TNF-α?xí)?dǎo)致異常復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，胰腺本身和胰腺外多種臟器功能受到這種級聯(lián)反應(yīng)不同程度的損害，因而可以引起全身系統(tǒng)炎性反應(yīng)[12-13]。肝損害也會隨著海拔的增高、氧氣量的下降而加重[14],肝細胞缺氧早期，機體的氧自由基產(chǎn)生增多，丙二醛含量升高，SOD活性下降，神經(jīng)-體液發(fā)揮各種調(diào)控及代償。但是超出機體代償范圍將引起肝臟細胞損傷[15]，缺氧可引起肝臟淤血，導(dǎo)致肝組織微循環(huán)障礙和營養(yǎng)不良，這些變化也會導(dǎo)致肝細胞膜通透性增加，加重肝細胞水腫及破壞胞內(nèi)和胞外的離子平衡[16]，電解質(zhì)代謝異常又加重肝損害。近年來，來高原旅游居住的人越來越多，常年安家在高海拔地區(qū)的人們也可能受慢性缺氧損害，有文獻報道，缺氧性肝損害與缺氧時間呈正相關(guān)[17],本實驗已證實大鼠胰腺炎嚴重程度及胰腺炎肝損害的嚴重程度隨海拔升高而增加，這啟示我們以后治療胰腺炎時應(yīng)該注重缺氧對病情的影響。

TNF-α是一種促炎因子，它在機體的自身免疫中具有重要的意義[18]。缺氧導(dǎo)致的乳酸和各種有機酸的堆積會導(dǎo)致代謝性酸中毒及細胞代謝障礙，這都可以使肝功能受損[19-20]。 Büyükakilli等人發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)與缺氧的情況想比較，缺氧情況下人的肝臟細胞釋放的TNF-α?xí)^正常升高，這可能對缺氧應(yīng)激做出的反應(yīng)。Xu等人研究表明缺氧可以激活致炎細胞。,缺氧以后信號通路PKC/NF-κB將被激活[21-22],其可以引起TNF-α信使RNA的表達水平顯著升高[23]導(dǎo)致TNF-α的分泌增加。Scannell等人還研究發(fā)現(xiàn),在眾多致炎細胞中，尤其是人單核細胞受低氧刺激后產(chǎn)生的TNF-α升高最為明顯，其受低氧刺激30 min后,TNF-α的表達和分泌即有明顯增高[22],另外，缺氧后導(dǎo)致TNF-α產(chǎn)生的機制還有很過種，包括產(chǎn)生的活性氧、表達和分泌增多的前列腺素H合成酶2 等，這些均可以造成肝臟的各項功能受損和肝臟產(chǎn)生病理變化。本實驗已證實大鼠SAP肝損害與TNF-α的產(chǎn)生呈正相關(guān)，而TNF-α的產(chǎn)生與缺氧呈正相關(guān)，這更進一步證實了大鼠SAP肝損害與缺氧呈正相關(guān)，這啟示我們在治療胰腺炎患者一方面要注重缺氧的影響，也要重視TNF-α的影響，二者均可加重胰腺炎肝損害的程度。

4 結(jié)論

本文資料顯示，同一時間下，大鼠胰腺炎病情的嚴重程度及SPA肝損傷程度均會隨海拔的增高而加重；同一海拔下，大鼠SAP肝損傷后TNF-α的表達隨時間延長而增加；同一時間下，大鼠SAP肝損傷后TNF-α的表達隨海拔的升高而增加，二者變化呈正相關(guān)。在高原低氧環(huán)境下，目前還是僅僅局限于組織、細胞水平適應(yīng)的簡單認識，而就其病理生理機制的研究目前仍處于基礎(chǔ)階段，有待深入研究。另外，在SAP治療方面，有部分患者療效欠佳，其機理有待商榷及進一步研究明確，需積極探究SAP成因的基礎(chǔ)上尋找新的治療靶點，應(yīng)更注重缺氧與TNF-α對SAP肝損害的影響。

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