二肽基肽酶-Ⅳ抑制劑對糖耐量減低Wistar大鼠胰島α細胞的影響*

張文娟，尹 飛，郭淑芹，周 雪，苑曉超，姚明言，李志紅

(河北省保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌二科 071000)

隨著現(xiàn)代生活方式的改變和社會老齡化的加劇，2型糖尿病、糖尿病前期發(fā)病率逐年增加。糖尿病前期包括空腹血糖調(diào)節(jié)受損(IFG)、糖耐量減低(IGT)2種情況。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(ADA)的預測，到2030年，全球糖尿病前期患者將達到4.7億[1]。國內(nèi)流行病學調(diào)查顯示，我國現(xiàn)有糖尿病患者9 240萬例[2]，居世界之首；糖尿病前期患者約占總?cè)丝诘?5.5%，約有1.48億人處于糖尿病前期。2010年成人流行病學統(tǒng)計顯示，我國糖尿病前期患病率為51.1%[3-4]。因此，如何對糖尿病前期人群進行科學有效的干預并降低糖尿病的發(fā)病率成為亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病前期已存在不同程度的胰島α細胞增生，例如注射鏈脲佐菌素的小鼠在發(fā)生糖尿病后可觀察到α細胞的增生，而應用二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制劑的小鼠并未出現(xiàn)該狀況。目前尚未有研究報道關(guān)于DPP-4抑制劑對IGT大鼠胰島α細胞的作用。本研究通過觀察西格列汀對IGT大鼠血糖、血脂代謝的影響，探討DPP-4抑制劑對IGT大鼠胰島α細胞的作用,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取4～5周齡雄性Wistar大鼠42只(購于河北醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心)，體質(zhì)量140～160 g，常規(guī)飼料適應性喂養(yǎng)1周后(6只/籠)，按大鼠體質(zhì)量大小編號，按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為健康對照組(NC組，14只)和IGT組(28只)。同組動物體質(zhì)量相差小于10%，各組間動物體質(zhì)量相差小于5%。NC組給予常規(guī)飼料，IGT組給予高糖高脂飼料(飼料提供熱量21.8 cal/g，其中脂肪占56.0%，蛋白質(zhì)占7.0%，碳水化合物占37.0%)。2組大鼠每日早晚各投食1次，投食量為體質(zhì)量的3%，均自由飲水，自由活動。室溫控制在18～22 ℃，光照周期12 h。飼養(yǎng)至12周時，行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)，具體方法：空腹10～12 h過夜，尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)后，立即給予50%葡萄糖注射液2 g/kg體質(zhì)量灌胃，服用2 h后再次鼠尾靜脈采血檢測血糖。

IGT診斷標準[5]：大鼠OGTT、餐后2 h血糖(2 hBG)為7.8～11.1 mmol/L，則為IGT造模成功。

1.2 方法 成模后按照隨機數(shù)字表法，將IGT組隨機分為IGT對照組和西格列汀組(Si組)，每組各14只大鼠。其中，Si組每日1次西格列汀灌胃[30 mg/(kg·d)]，NC組及IGT對照組均給予等體積生理鹽水灌胃，2組繼續(xù)以高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周。

于干預前后在3組大鼠中各取50%，禁食12 h后稱重，檢測FBG、2 hBG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)水平。腹腔注射5%水合氯醛麻醉，處死動物，快速提取大鼠胰腺組織。

標本處理：所得胰腺組織以10%甲醛溶液固定，常規(guī)切片后行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光鏡下觀察胰島形態(tài)學改變；采用免疫組織化學染色法觀察胰島α細胞面積的變化，顯色結(jié)果采用IPP6.0系統(tǒng)，根據(jù)胰島α細胞胰高血糖素標記陽性面積的百分比進行定量分析。每張標本隨機選取5個視野，計算每個視野內(nèi)染色區(qū)域的胰高血糖素陽性面積占所觀察胰腺組織面積的比值，取每個標本的平均值進行統(tǒng)計分析。采用免疫熒光單標法測定胰島α細胞胰高血糖素蛋白的表達情況，顯色結(jié)果采用IPP6.0系統(tǒng)根據(jù)顯色面積和強度進行定量分析。分析結(jié)果采用吸光度(IOD)值表示，圖像分析的IOD=lg(背景平均灰度值/待測目標平均灰度值)。標本的熒光顯色顏色越深，分布范圍越廣，IOD值越大，陽性物質(zhì)相對水平越大。每張標本隨機選取5個高倍視野(×150)，計算每個視野內(nèi)染色區(qū)域的IDO值，取每個標本的平均值進行統(tǒng)計學處理。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體質(zhì)量、血糖和血脂的比較 干預前，與NC組比較，IGT組、Si組的大鼠體質(zhì)量均增加，2 hPG、TG、TC水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3組FBG水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；IGT組和Si組的大鼠體質(zhì)量、FBG、2 hPG、TG及TC水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。西格列汀干預4周后，與同期IGT組及干預前Si組比較，Si組的大鼠體質(zhì)量、2 hPG、TG及TC水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；FBG水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC組比較，上述指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量、血糖和血脂的比較

注：與NC組比較，△P<0.05；與IGT組比較，*P<0.05；同組間干預前后比較，#P<0.05

2.2 大鼠胰高血糖素、胰島α細胞面積和胰高血糖素表達情況比較 干預前，與NC組比較，IGT組、Si組的胰高血糖素水平、胰島α細胞面積百分比和胰高血糖素表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。西格列汀干預4周后，與同期IGT組及干預前Si組比較，Si組的大鼠胰高血糖素水平降低，胰島α細胞面積百分比和胰高血糖素表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC組比較，上述指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 大鼠胰高血糖素、胰島α細胞面積和胰高血糖素表達情況比較

注：與NC組比較，△P<0.05；與IGT組比較，*P<0.05；同組間干預前后比較，#P<0.05

注：A為干預前NC組，B為干預前IGT對照組，C為干預前Si組，D為干預后NC組，E為干預后IGT對照組，F(xiàn)為干預后Si組

圖1 各組大鼠干預前后胰島α細胞胰高血糖素蛋白表達情況

3 討 論

IGT是糖尿病前期最常見的表現(xiàn)，幾乎是糖尿病的必經(jīng)階段。研究證明，IGT階段已存在血清胰高血糖素升高，胰島α細胞增生情況。因此，對糖尿病前期患者進行干預，對于抑制胰島α細胞增生及逆轉(zhuǎn)胰島細胞功能，阻止其發(fā)展成糖尿病具有重要意義。

腸促胰素屬于胃腸道激素，是由胃腸道內(nèi)分泌細胞分泌，主要包括胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和葡萄糖依賴的促胰島素分泌多肽(GIP)，兩者均可通過促進胰島素分泌降低血糖，且不會使患者出現(xiàn)低血糖[6]。但GLP-1在體內(nèi)不穩(wěn)定，易被二肽基肽酶-Ⅳ水解，半衰期較短。DPP-4抑制劑能夠有效抑制二肽基肽酶-Ⅳ的活性，從而提高GLP-1和GIP水平，延長其作用時間，促進胰島素的分泌[7-8]。此外，DPP-4抑制劑還能通過抑制GLP-1和GIP的降解，間接促進胰島β細胞增殖，有抑制食欲、延緩胃排空的作用。其還能通過抑制肝糖原輸出、增加葡萄糖利用等方式增強胰島素敏感性。本研究結(jié)果顯示，西格列汀干預4周后，Si組大鼠無論是與干預前比較，還是與IGT對照組比較，體質(zhì)量更小，尤以下腹部最為明顯，動作更加敏捷，反應更加靈敏。此外，Si組大鼠2 hPG、TG、TC水平也明顯下降，提示西格列汀不僅能夠減輕IGT大鼠的體質(zhì)量，改善糖尿病前期的臨床特征，還能降低餐后血糖，改善脂代謝紊亂。這進一步表明，西格列汀可能具有阻止糖尿病前期向糖尿病發(fā)展的功能，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[9-10]。

西格列汀主要通過增加血清GLP-1水平發(fā)揮生理作用。(1)GLP-1可直接促進胰島素的分泌，從而提高血清胰島素水平[11]。其通過增加胰島素mRNA的穩(wěn)定性、上調(diào)胰島素的基因轉(zhuǎn)錄和生物合成等方式，補充β細胞的胰島素儲存量，防止β細胞耗竭[12]。(2)GLP-1可有效抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素。有研究表明，GLP-1不僅能降低2型糖尿病患者的血清胰高血糖素水平，還可改善1型糖尿病(T1DM)患者的胰島α細胞功能。FARGREN等[13]的研究顯示，T1DM患者在接受維格列汀治療4周后，餐后血清胰高糖素水平(餐后120 min胰高糖素曲線下面積)明顯低于接受安慰劑治療的人群。本研究結(jié)果顯示，西格列汀干預IGT大鼠后，免疫組織化學檢測胰島α細胞胰高血糖素陽性面積百分比低于IGT對照組，免疫熒光標記胰島α細胞胰高血糖素弱于IGT對照組，胰島中央部分布減少，血清胰高血糖素水平降低，提示西格列汀干預后，胰島α細胞數(shù)量減少，胰高血糖素的合成和分泌減少，說明西格列汀可以改善IGT階段胰島a細胞數(shù)量和分泌功能。(3)GLP-1主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學效應。研究證實，胰島a細胞存在GLP-1受體。研究顯示，GLP-1可直接激活激酶A(PKA)，繼而抑制胰島a細胞上的N型鈣離子通道，小幅度增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，減少胰高血糖素的胞吐作用，抑制胰高血糖素的分泌。(4)GLP-1能促進胰島素分泌。研究發(fā)現(xiàn)，在胰島素信號通路參與抑制胰高血糖素分泌的過程中，GLP-1可通過胰島素、生長抑素等旁分泌途徑作用于胰高血糖素。目前關(guān)于GLP-1抑制胰高血糖素分泌是否通過胰島素介導的結(jié)論不一：有學者表示GLP-1可誘導胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，促進胰島素的成熟和分泌，通過胰島素間接抑制胰高血糖素的分泌；也有學者證實GLP-1不能直接抑制胰高血糖素分泌，必須有生長抑素底物-2介導，提示生長抑素可能作為中間橋梁介導GLP-1抑制胰高血糖素分泌的作用。GLP-1與胰島a細胞上的GLP-1受體結(jié)合，刺激生長抑素的分泌增加；升高的生長抑素作用于胰島a細胞，抑制胰高血糖素的分泌。(5)GLP-1改善胰島素抵抗。研究證實，高糖高脂飲食誘導的IGT及2型糖尿病階段已經(jīng)存在胰島a細胞胰島素抵抗。GLP-1可能通過改善胰島素抵抗，抑制胰高血糖素的分泌。研究顯示，IGT階段存在胰島素抵抗狀態(tài)，給予GLP-1受體激動劑Exendin-4干預后，胰島素抵抗改善，全身組織對胰島素的敏感度增加，糖負荷后胰島a細胞的功能恢復，感知胰島素作用能力增強，胰高血糖素分泌被抑制。

綜上所述，西格列汀可下調(diào)胰島α細胞面積及胰高血糖素蛋白表達，降低餐后血糖和胰高血糖素水平。

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