膠原蛋白酶解制備肽工藝研究進展

張崟，郭思亞，熊偉，向鵬妍，吳婷，孟婧，張婷

(成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106)

畜禽及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，如畜禽骨、畜禽皮、魚皮、魚鱗、魚頭、魚骨、魚鰭等，其中含有豐富的膠原蛋白。由于膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量較高，所以常用其制備氨基酸或作為補充甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的蛋白質(zhì)原料。近年來，有關(guān)膠原蛋白功能性的最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白水解所得的膠原肽，不僅表現(xiàn)出很好的可消化性，而且還具有保護胃黏膜、抗氧化、抗?jié)?、抗衰老、抗過敏、降血壓、促進軟骨再生、促進角膜上皮細胞的修復(fù)和生長，促進皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等諸多獨特的生理活性[1-3]。因此，水解膠原蛋白制備肽的工藝及膠原肽的功能性研究越來越多地受到國內(nèi)外科研機構(gòu)的重視。

目前，常用的制備膠原肽的方法主要有酸法、堿法和酶法[4,5]。酸法和堿法均采用化學(xué)試劑促使膠原蛋白分解產(chǎn)生小分子肽。這兩種水解方法不僅過程難以控制，而且反應(yīng)比較強烈，會造成氨基酸變性，產(chǎn)生有毒物質(zhì)等不利結(jié)果[6]。因此，使用可替代化學(xué)法的酶法水解膠原蛋白技術(shù)日益受到重視。酶法水解膠原蛋白不僅反應(yīng)條件溫和，具有較高的回收率，而且水解反應(yīng)速率快，對環(huán)境污染較小，所得膠原肽較酸法和堿法更安全。因此，被廣泛應(yīng)用于功能性食品、化妝品及其他產(chǎn)品開發(fā)[7]。為了更好地促進酶法水解膠原制備肽工藝改進和對酶解肽功能性的研究，本文對近年來有關(guān)酶法水解膠原蛋白制備肽的工藝進行了對比分析。

1 膠原蛋白概述

膠原蛋白又名膠原質(zhì)，是一種白色、不透明、無支鏈的纖維狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。膠原分子有著典型的長且堅韌的三螺旋結(jié)構(gòu)，由2條α1肽鏈和1條α2肽鏈組成。3條α肽鏈交互纏繞形成繩索狀的超螺旋結(jié)構(gòu)。每條肽鏈的序列為連續(xù)重復(fù)的Gly-X-Y(X為脯氨酸，Y為羥脯氨酸或羥賴氨酸)[8]。

2 酶解膠原肽的功能性及用途

膠原蛋白獨特的三股超螺旋結(jié)構(gòu)使其具有十分穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，微弱的酸很難使其分解。因此膠原蛋白難以被人體直接消化利用。但是，將膠原蛋白水解，形成分子量較小的膠原多肽后，可顯著提高其生物利用性，更有利于被人體吸收和利用[9]。酶法水解膠原蛋白制備膠原肽的原理是通過蛋白酶，如膠原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等對其進行水解，得到多肽[10]。

常見的酶解膠原蛋白制備膠原肽的反應(yīng)條件、所得肽的功能性及用途見表1。酶解膠原蛋白所得肽具有抗氧化、ACE抑制、抗菌活性，其主要用途包括清除自由基、防止脂質(zhì)過氧化、降血壓及抗菌?？蓪⒚附饽z原肽添加到點心、乳制品及其他食品中，改善食品的營養(yǎng)價值[11]。還有將膠原蛋白肽添加于飲料中，制作體能恢復(fù)性飲料的報道。近年來，酶解膠原蛋白制備膠原肽的研究已全面展開，而且隨著國內(nèi)外對膠原蛋白肽研究的不斷深入，膠原肽的功能性及其利用價值將會被更多地發(fā)掘。

表1 酶解膠原蛋白的產(chǎn)物特性及其用途Table 1 Characteristics and applications of enzymatic hydrolysates of collagen

注：ACE指血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme)。

3 酶解膠原蛋白工藝分類

膠原蛋白的來源及其類型不同，其中的氨基酸構(gòu)成及多肽的種類會出現(xiàn)差異。在采用酶法水解膠原蛋白時，酶的選擇和酶解工藝對膠原肽的制備有重要影響。通過分析近年來國內(nèi)外膠原蛋白的酶解工藝發(fā)現(xiàn)，目前酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解和多酶水解兩種方法，其中多酶水解法又分為混合酶水解法或分步酶水解法。酶解膠原蛋白的工藝選取通常應(yīng)考慮要開發(fā)的產(chǎn)品對肽分子量的要求。如果欲得到分子量較小的膠原多肽，一般采用多酶水解法，反之則采用單酶水解法[24]。

3.1 單酶水解法

在單酶水解膠原蛋白工藝建立上，國內(nèi)外研究人員多在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用正交實驗或響應(yīng)面法設(shè)計實驗方案，然后建立最優(yōu)的酶解工藝[25-27]。采用單酶水解膠原蛋白的酶解工藝及酶解效果比較見表2。

表2 單酶酶解膠原蛋白工藝比較Table 2 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with one proteinase

續(xù) 表

由表2可知，在原料方面，涉及的畜禽加工副產(chǎn)物包括畜禽骨、皮；水產(chǎn)加工副產(chǎn)物包括鱗、皮、肉及骨，其中畜禽加工副產(chǎn)物中酶解骨膠原制備肽的工藝較多；在水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物方面，水解魚鱗膠原的報道較多。

在酶的來源方面，以外加蛋白酶居多，其次是采用內(nèi)源性蛋白酶水解膠原制備肽。酶用量、酶解溫度、酶解時間及pH對酶解效果影響大，以魚鱗為例，采用菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶水解，兩者的水解度差異近2倍。

畜禽骨的水解度在1.613%～32.46%變化。在水產(chǎn)加工副產(chǎn)物方面，可能受原料和酶解條件的共同影響，水解度的變化較大，在1.46%～36.2%變化，其中羅非魚下腳料的水解度最高。在水解產(chǎn)物功能性方面，單酶水解效果多采用水解度評價水解效果，其次是膠原蛋白提取率、自由基清除率及ACE抑制活性。

3.2 混合酶水解法

由于酶的專一性，采用單酶水解膠原蛋白時，只能分解其中一些具有特定結(jié)構(gòu)的肽鍵。因此，底物結(jié)構(gòu)對單酶水解效果影響較大。隨著水解時間增加，水解度不會再增加，而且水解程度受限，所得膠原肽的分子量一般較大。為了避免單酶水解的這一缺陷，近年來出現(xiàn)了采用多種酶混合法對膠原蛋白進行水解的報道(見表3)。多種蛋白酶的混合，可以發(fā)揮不同酶的水解特性，優(yōu)勢互補，實現(xiàn)對膠原蛋白的多位點分解。因此，所得酶解產(chǎn)物的水解度較高，有利于提高底物轉(zhuǎn)化率，縮短水解時間[64]。多酶水解還可以減少因為單酶水解不徹底，造成疏水性氨基酸含量較高而引起酶解液苦味較重[65]、酶解液風(fēng)味不足、腥味較重等不利結(jié)果[66,67]。

表3 混合酶水解膠原蛋白工藝Table 3 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with poly-proteinase

由表3可知，在原料方面，混合酶解用到的畜禽副產(chǎn)物包括豬骨、雞骨及雞皮、豬皮，水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物方面有魚皮及魚鱗。在酶的混合方式方面，以雙酶酶解居多，其次是三酶水解，尚未見有4種或更多酶復(fù)合酶解的報道。比較表2和表3中豬皮的水解度可知，多酶酶解使豬皮的水解度提高了近1倍，由單酶水解度9.55%到雙酶水解度17.7%。在酶解效果評價方面，目前報道的文獻主要有水解度和肽回收率對酶解效果進行評價，未見對酶解肽的功能性評價。

3.3 分步酶水解法

蛋白酶按作用位點可分為內(nèi)切酶和外切酶。內(nèi)切酶的種類主要有胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶；外切酶主要有菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、動物蛋白水解酶。內(nèi)切酶從肽鏈內(nèi)部將多肽水解成小片斷，外切酶作用于肽鏈末端的肽鍵，逐個將氨基酸水解下來。在混合酶水解膠原蛋白基礎(chǔ)上，應(yīng)用復(fù)合酶分步水解，在酶解第一階段先使用內(nèi)切酶，使蛋白質(zhì)顆粒水解成肽片段，第二階段再使用肽鏈外切酶進一步水解，減小肽鏈的長度，降低水解液中的疏水氨基酸的比率，進一步提高水解度和改善風(fēng)味[76,77]。分步復(fù)合酶水解膠原蛋白，能克服單一酶解反應(yīng)中酶解程度受限，混合酶水解時可能會出現(xiàn)酶相互抑制的問題。分步酶解的缺點是工藝復(fù)雜，酶解效果還要根據(jù)相應(yīng)指標(biāo)如水解度、酶解物風(fēng)味及抗氧化性等來確定。近年來報道的分步酶水解膠原蛋白工藝比較見表4。

表4 分步酶水解膠原蛋白工藝Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis of collagen protein with proteinase step by step

由表4可知，在原料方面，分步酶解采用的畜禽副產(chǎn)物原料有畜禽皮和骨，水產(chǎn)副產(chǎn)物方面主要是骨和皮。分步酶解采用的酶多為雙酶，其次是三酶水解，尚未見有4種或更多酶分步酶解的報道。在酶解效果方面，涉及的評價指標(biāo)包括水解度、自由基清除率、鈣離子螯合率及ACE抑制活性。比較表2和表3發(fā)現(xiàn)，分步酶解涉及的原料還比較少。因此，未來可在酶分步水解方面做更多探索。

4 膠原蛋白酶解過程存在的問題

盡管目前國內(nèi)外已經(jīng)對膠原蛋白的酶解工藝開展了較為廣泛的研究，但是目前尚存在的問題：(1)酶解效率不高。因膠原蛋白的天然硬質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶解效率低，產(chǎn)物的回收率不高的現(xiàn)象較普遍。以水解度為例，單酶水解度最高的尚達不到50%，但導(dǎo)致問題的機理尚不清楚。(2)原料的一致性有待改進。畜禽及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的差異，導(dǎo)致酶解制備膠原肽的原料一致性難以保障。原料的一致性會引起后續(xù)實驗的可重復(fù)性和實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。(3)酶的種類與水解效果缺乏統(tǒng)一。從本文中的酶解膠原文獻可以發(fā)現(xiàn)，酶解時使用的原料較廣泛，采用的酶種類也較多，尚缺乏酶的種類和原料酶解效果的統(tǒng)一，這直接導(dǎo)致工業(yè)化應(yīng)用時缺乏依據(jù)。

5 結(jié)論

我國是畜禽和水產(chǎn)品生產(chǎn)大國，每年產(chǎn)生的畜禽及水產(chǎn)品副產(chǎn)物量大，如何將這些副產(chǎn)物高附加值利用，減少資源浪費和環(huán)境污染，是直接影響我國畜禽及水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵制約因素。目前國內(nèi)外已經(jīng)在畜禽及水產(chǎn)品副產(chǎn)物利用萬面開展了一些探索。隨著我國的環(huán)境保護要求越來越高，節(jié)能、綠色、環(huán)保的新技術(shù)在畜禽及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物回收利用中的應(yīng)用將越來越受到重視。本文對近年來有關(guān)低污染、高效、節(jié)能的生物酶解技術(shù)在畜禽及水產(chǎn)品副產(chǎn)物利用的研究進展進行了對比分析，通過分析發(fā)現(xiàn)，在膠原酶解工藝方面，主要以單酶水解工藝居多，其次是多酶水解技術(shù)。在原料方面，涉及更多的骨、鱗及皮。在產(chǎn)物評價方法方面，更多的是采用水解度、自由基抑制率及肽的提取率、ACE抑制活性。在今后的研究中，期待在酶解效率提高及其機理探索、膠原肽的功能性評價、原料一致性及酶的種類差異與酶解效果評價關(guān)系方面有更多探索。

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