NLRP3炎癥小體與糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)系及中藥干預(yù)作用

孫 青，梁曉春

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100730

炎癥小體的概念最早由Martinon等[1]提出，其來(lái)源主要是模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)樣受體(NOD-like receptors，NLRs)在活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)- 1的過(guò)程中形成的大分子蛋白復(fù)合體，而該過(guò)程對(duì)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β等炎癥因子的成熟、分泌起到重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器黑色素缺乏因子(absent in melanoma，AIM)、白細(xì)胞介素轉(zhuǎn)換酶激活因子(interleukin- 1β converting enzyme protease-activating factor，IPAF)等，其中以NLRP3研究最為深入。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體激活是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[2]，后續(xù)研究集中于NLRP3炎癥小體在糖尿病慢性并發(fā)癥中的作用，本文總結(jié)了該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

NLRP炎癥小體的組成與激活

NLRP3炎癥小體的組成NLRP3炎癥小體主要由感受器NLRP3蛋白、適配蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)及效應(yīng)蛋白caspase- 1前體(pro-caspase- 1)組成。NLRP3蛋白的主要結(jié)構(gòu)為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD/NACHT)及其C-端的亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)和N-端的胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase-activating and recruitment domain，CARD)或熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)[3]。Caspase家族主要與細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)相關(guān)，作為caspase家族的一員，caspase- 1主要參與炎癥反應(yīng)，其與促炎細(xì)胞因子IL- 1β和IL- 18前體的成熟、分泌密切相關(guān)，在NLRP3炎癥小體促炎作用中發(fā)揮核心作用。ASC主要結(jié)構(gòu)包括與NLRP3蛋白連接的PYD和與pro-caspase- 1連接的CARD。作為鏈接蛋白的ASC，其磷酸化在炎癥體激活過(guò)程中尤為重要，并且酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)能上調(diào)ASC的磷酸化[4]。在受到細(xì)胞內(nèi)特定信號(hào)剌激時(shí)，NLRP3 發(fā)生寡聚化，逐步招募 ASC 和pro-caspase- 1形成多蛋白復(fù)合物，誘導(dǎo)后者自我剪切成活化的caspase- 1，進(jìn)而將前體形式的IL- 1β 和IL- 18 剪切成具有活性的 IL- 1β 和 IL- 18，調(diào)控其成熟、分泌，參與下游炎癥反應(yīng)[5]。

NLRP3炎癥小體的激活與Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)不同，NLRP3主要在細(xì)胞內(nèi)感受刺激呈遞信號(hào)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，多種外源性和內(nèi)源性刺激物均可激活NLRP3炎癥小體，如脂多糖[1]、尿酸鹽結(jié)晶、游離脂肪酸及細(xì)胞外ATP等[7]。目前認(rèn)為NLRP3炎癥小體的激活過(guò)程主要有以下3條途徑：(1)K+通道模型：病原體、損傷壞死細(xì)胞等釋放的ATP刺激嘌呤受體P2X7依賴的離子通道開放，促進(jìn)K+外流和泛連接蛋白(pannexin- 1)膜通道形成，使胞外小分子配體通過(guò)pannexin- 1通道進(jìn)入胞內(nèi)激活NLRP3炎癥小體。(2)溶酶體破壞模型：細(xì)胞外結(jié)晶體或特殊顆粒通過(guò)內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致溶酶體破裂，釋放組織蛋白酶B(cathepsin B)激活NLRP3炎癥小體。(3)活性氧(reactive oxygen species，ROS)模型：細(xì)胞內(nèi)ROS增多可直接激活NLRP3炎癥小體，或引起氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)蛋白硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)與硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)解離，TXNIP隨之結(jié)合NLRP3促進(jìn)炎癥小體聚集和活化[3]。此外，NLRP3炎癥小體的激活還涉及TLRs和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的相關(guān)通路[8]。

NLRP3炎癥小體與糖尿病慢性并發(fā)癥

NLRP3炎癥小體與糖尿病視網(wǎng)膜病變最新臨床研究發(fā)現(xiàn)，增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者玻璃體中炎癥小體組分NLRP3、caspase- 1及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、IL- 18表達(dá)均增加，但I(xiàn)L- 1β、TNF-α、IL- 6和干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)水平與非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy，non-PDR)比較無(wú)明顯差異，提示NLRP3炎癥小體激活參與PDR進(jìn)展，而急性炎癥或T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)則不占主導(dǎo)地位[9]。另有學(xué)者證實(shí)，糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜組織中TXNIP、ROS、炎癥小體組分NLRP3、ASC、caspase- 1和炎癥因子IL- 1β、IL- 18表達(dá)均增加，同時(shí)觀察到細(xì)胞凋亡和血管通透性增加，而TXNIP基因沉默可降低ROS水平并抑制NLRP3炎癥小體活化，NLRP3基因沉默則下調(diào)下游炎癥反應(yīng)[10]。此外，自噬可能參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體活化，研究證實(shí)高糖刺激可增加人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞自噬，而抑制自噬可引起線粒體功能障礙、ROS生成增多，從而使NLRP3炎癥小體活化，IL- 1β分泌增加[11]。一般認(rèn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)屬微血管病變，但近期研究發(fā)現(xiàn)，DR還表現(xiàn)為周圍神經(jīng)損傷，慢性高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中TXNIP表達(dá)增加，可引起固有免疫應(yīng)答，將氧化應(yīng)激與炎癥聯(lián)系起來(lái)，表現(xiàn)為ROS產(chǎn)生、ATP釋放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活NLRP3炎癥小體，最終分泌IL- 1β、TNF-α等炎癥因子[12]。

NLRP3炎癥小體與糖尿病腎病糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)目前已成為終末期腎病的第2位原因，僅次于各種腎小球腎炎。有學(xué)者通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎臟組織中TXNIP、NLRP3和IL- 1β的陽(yáng)性率增加，進(jìn)一步證實(shí)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞中TXNIP、NLRP3、procaspase- 1和IL- 1β的蛋白及mRNA表達(dá)均呈劑量和時(shí)間依賴性增加，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可顯著抑制上述病變，提示ROS/TXNIP/NLRP3/IL- 1β信號(hào)通路在DN發(fā)病中的作用[13]。在鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠腎臟組織中除高血糖外，還存在血脂異常和高尿酸血癥，這些因素共同導(dǎo)致炎癥小體組分NLRP3、ASC和caspase- 1表達(dá)增加，致使IL- 1β和IL- 18升高，引起腎臟損害惡化[14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病腎病患者腎小管上皮細(xì)胞中嘌呤受體P2X4表達(dá)增加，且與NLRP3、IL- 1β和IL- 18共表達(dá)，與尿IL- 1β和IL- 18水平呈正相關(guān)；進(jìn)一步研究證實(shí)，高糖刺激可增加腎小管上皮細(xì)胞系中NLRP3、活化的caspase- 1、IL- 1β、IL- 18及ATP蛋白的表達(dá)，通過(guò)消耗細(xì)胞外ATP可完全逆轉(zhuǎn)上述改變，P2X4選擇性拮抗劑以及P2X4基因沉默均可削弱NLRP3及炎癥因子表達(dá)。提示ATP-P2X4信號(hào)通路介導(dǎo)高糖刺激的NLRP3炎癥小體活化，從而導(dǎo)致DN小管間質(zhì)性炎癥的發(fā)展[15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，有14個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)與DN有關(guān)，其中僅lncRNA-Gm4419與NF-κB有聯(lián)系，Gm4419敲除可顯著抑制高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中炎癥因子和腎臟纖維化生物標(biāo)志物的表達(dá)，減少細(xì)胞增殖，該作用可能與Gm4419和NF-κB p50亞基相互作用，進(jìn)一步結(jié)合NLRP3炎癥小體有關(guān)，提示調(diào)節(jié)Gm4419可能成為DN治療的新靶點(diǎn)[16]。

NLRP3炎癥小體與糖尿病心肌病糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心力衰竭甚至死亡。我國(guó)學(xué)者最先發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在DCM發(fā)病進(jìn)程中占據(jù)重要地位，NLRP3基因沉默可下調(diào)2型糖尿病大鼠心肌組織中NLRP3、ASC、pro-caspase- 1、caspase- 1以及IL- 1β的表達(dá)，并改善心肌炎癥狀態(tài)、細(xì)胞焦亡、纖維化和心臟功能。通過(guò)抑制ROS能夠顯著減少NF-κB磷酸化和TXNIP表達(dá)，從而抑制NLRP3炎癥小體活化，該作用可能與絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路有關(guān)[17- 18]。高糖刺激可導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)下降，NLRP3炎癥小體激活，下游炎癥因子IL- 1β和IL- 18升高，并發(fā)現(xiàn)caspase- 3表達(dá)和細(xì)胞凋亡增加，該過(guò)程是通過(guò)TLR4/NF-κB通路介導(dǎo)的[19]。胚胎致死異常視覺(jué)蛋白(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)- 1是一種在炎癥和心力衰竭進(jìn)程中起關(guān)鍵作用的蛋白。最新研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者心肌組織中伴隨著ELAVL1表達(dá)增加可見caspase- 1和IL- 1β水平升高，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)ELAVL1基因敲除可通過(guò)下調(diào)NLRP3、caspase- 1和IL- 1β而減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡。生物信息學(xué)顯示microRNA- 9直接指向ELAVL1，在高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞和糖尿病患者心肌組織中均可見microRNA- 9表達(dá)減少，應(yīng)用microRNA- 9類似物可減少高糖刺激心肌細(xì)胞ELAVL1表達(dá)，抑制細(xì)胞焦亡，提示microRNA- 9/ELAVL1可能是糖尿病心肌病治療的新靶標(biāo)[20]。此外，糖尿病還可導(dǎo)致心律失常，其中最常見和致死性的是室性心動(dòng)過(guò)速。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠心臟巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化可使IL- 1β生成增加，導(dǎo)致動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，鉀內(nèi)流減少、鈣活化增加，最終引起心律失常[21]。

NLRP3炎癥小體與糖尿病大血管病變糖尿病是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素之一，臨床研究將181例2型糖尿病患者血NLRP3炎癥小體基因型分為NLRP3 rs35829419和CARD8 rs2043211，結(jié)果顯示除病程和血漿膽固醇水平外，NLRP3 rs35829419是大血管并發(fā)癥的重要危險(xiǎn)因素，而CARD8 rs2043211則與任何糖尿病并發(fā)癥無(wú)關(guān)[22]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化病變的豬模型主動(dòng)脈斑塊中可見煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)依賴的脫乙酰酶SIRT1和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)表達(dá)被抑制，進(jìn)而削弱SIRT1介導(dǎo)的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)- 1的脫乙酰作用和AMPK依賴的SREBP- 1的Ser- 372位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致SREBP- 1的蛋白水解被活化。異?；罨腟REBP刺激靶基因表達(dá)，參與脂肪生成和膽固醇合成，加速血管壁脂肪沉積；另一方面，有毒的脂質(zhì)、膽固醇結(jié)晶和壞死細(xì)胞均可活化NLRP3炎癥小體，使caspase- 1依賴的IL- 1β分泌增加，通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)血管炎癥，導(dǎo)致血管功能障礙[23]。另外，高糖暴露可通過(guò)肌醇依賴酶(inositol-requiring enzyme，IRE)- 1α磷酸化導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而上調(diào)TXNIP表達(dá)，激活氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體，使IL- 1β和IL- 6分泌增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，破壞內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)，其作用可能與AMPK通路有關(guān)[24]。近期研究證實(shí)，與野生型2型糖尿病小鼠相比，脂聯(lián)素基因敲除小鼠主動(dòng)脈組織中NLRP3炎癥小體活化和血管內(nèi)皮損傷顯著增加，而應(yīng)用NLRP3炎癥小體選擇性抑制劑MCC950可顯著減輕上述病變，提示低脂聯(lián)素血癥誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化是糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙的新機(jī)制[25]。

NLRP3炎癥小體與其他糖尿病合并癥在2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)小鼠肝臟中，NLRP3、活化的caspase- 1、pro- IL- 1β和IL- 1β表達(dá)均增加，血漿中IL- 1β、IL- 6、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein 1，MCP)- 1以及ALT/AST水平亦升高，且與膽固醇結(jié)晶形成和肝臟炎癥、纖維化等病理改變一致。同時(shí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中膽固醇結(jié)晶可激活Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促使IL- 1β分泌和中性粒細(xì)胞遷移[26]。此外，STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟組織中可見TXNIP過(guò)表達(dá)，NLRP3炎癥小體激活，ROS和IL- 1β生成增加；并可下調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR)α、上調(diào)SREBP- 1c、SREBP- 2、脂肪酸合酶以及肝臟X受體α表達(dá)，提示肝臟炎癥反應(yīng)和脂肪積聚可能共同參與1型糖尿病合并NAFLD進(jìn)展[27]。利用高糖培養(yǎng)的牙齦卟啉單胞菌刺激人牙齦成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中NLRP3和IL- 1β表達(dá)增加，進(jìn)一步研究顯示Akt和p70S6K通路激活介導(dǎo)的SREBP- 1c水平上調(diào)在NLRP3活化中起重要作用，而抑制Janus激酶(Janus kinase，JAK)2能夠阻礙蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)和核糖體S6蛋白激酶(ribosome S6 protein kinase，p70S6K)介導(dǎo)的SREBP- 1c、NLRP3和IL- 1β表達(dá)。另外，糖尿病合并牙周病患者的牙齦組織中也發(fā)現(xiàn)NLRP3和SREBP- 1c高表達(dá)，提示SREBP- 1c調(diào)節(jié)的NLRP3炎癥小體活化可能為糖尿病合并牙周病的新靶點(diǎn)[28]。

中藥對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥NLRP3炎癥小體的干預(yù)作用

目前中藥對(duì)于糖尿病慢性并發(fā)癥NLRP3炎癥小體的干預(yù)研究?jī)H局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面。研究發(fā)現(xiàn)，天然黃酮類化合物槲皮素廣泛存在于槐角、柴胡、桑葉、菟絲子等中藥材中，具有抗氧化應(yīng)激及抗炎作用，可通過(guò)抑制DN大鼠腎臟組織中炎癥小體組分NLRP3、ASC和caspase- 1的表達(dá)，以及調(diào)脂和降尿酸作用，從而減輕炎癥反應(yīng)及腎臟損害[14]。此外，槲皮素還可通過(guò)減少糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟中TXNIP過(guò)表達(dá)，改善氧化應(yīng)激和抑制NLRP3炎癥小體激活，并可減輕脂肪積聚，延緩NAFLD進(jìn)展[27]。芒果苷是中藥知母的主要活性成分，除具有抗氧化和抗炎作用外，還可降糖、調(diào)脂，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可通過(guò)下調(diào)高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞IRE1α磷酸化而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而抑制TXNIP/NLRP3炎癥小體活化，促進(jìn)血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)，其作用可能與AMPK通路有關(guān)[24]。我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)參芍口服液(由丹參、黃芪、赤芍等組成)可降低DN大鼠血糖、減輕腎臟纖維化、保護(hù)腎功能，其機(jī)制可能與降低腎臟組織中炎癥小體組分NLRP3、caspase- 1、IL- 1β的表達(dá)有關(guān)[29]。

小結(jié)與展望

糖尿病慢性并發(fā)癥中NLRP3炎癥小體激活的主要作用機(jī)制包括ROS-TXNIP、ATP-P2X4及NF-κB通路，進(jìn)一步活化caspase- 1，使IL- 1β、IL- 18分泌增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，其中氧化應(yīng)激發(fā)揮關(guān)鍵作用，將各個(gè)途徑聯(lián)系起來(lái)(圖1)。由于NLRP3炎癥小體在糖尿病慢性并發(fā)癥中的重要地位，尋找靶向于NLRP3炎癥小體的治療藥物就具有深遠(yuǎn)意義。中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、雙向調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，目前關(guān)于中藥復(fù)方或單體干預(yù)NLRP3炎癥小體的研究較少，且集中于對(duì)炎癥小體組分和下游炎癥因子表達(dá)的影響，未從基因角度探討NLRP3基因沉默后中藥的具體作用靶點(diǎn)，未深入研究NLRP3激活的上游通路，未形成多環(huán)節(jié)、系統(tǒng)性和網(wǎng)絡(luò)化的整體研究。另外，探索發(fā)揮具體作用的單味中藥或有效單體，明確中藥復(fù)方的有效藥物及成分，亦是未來(lái)研究的方向。

圖1NLRP3炎癥小體在糖尿病慢性并發(fā)癥中的作用機(jī)制

Fig1Roles of NLRP3 inflammasome in chronic complications of diabetes

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