雙線紫蛤(Soletellina diphos)形態(tài)、序列測(cè)定和同工酶的初步研究

(1.莆田市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 莆田 351100； 2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361013)

雙線紫蛤(Soletellinadiphos)隸屬于簾蛤目(Veneroida)、櫻蛤總科(Tellinoidea)、紫云蛤科(Psammobiidae)、紫蛤?qū)?Soletellina)，其斧足肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是一種名貴的底棲雙殼類(lèi)，也是福建省省級(jí)重點(diǎn)保護(hù)水生野生動(dòng)物之一，由于海域環(huán)境驟變和人為因素破壞，曾經(jīng)廣泛分布在莆田市南日島周邊海域的雙線紫蛤自然野生種群資源，目前已銳減。國(guó)內(nèi)外對(duì)雙線紫蛤的研究尚不充分，文獻(xiàn)檢索集中在人工繁育[1-2]、性狀差異[3]、血細(xì)胞分類(lèi)[4]、毒素[5-8]及重金屬[9]毒理、生化成分[10]和機(jī)體代謝[11-12]等領(lǐng)域，極少涉及分子遺傳[13]方向。紫蛤?qū)俚姆N間形態(tài)較為相似，部分學(xué)名、俗名和同種異名的處理使用及其對(duì)應(yīng)的翻譯仍未很好的統(tǒng)一，例如雙線紫蛤(中國(guó))的命名，也有學(xué)者報(bào)道采用雙線血蛤、雙線血蚶、雙線紫云蛤、西施舌(臺(tái)灣地區(qū))、雙線西施舌、西刀舌、西肚舌、紫晃肉、紫蛤、紫貝、富士紫貝、Hiatuladiphos(中國(guó)、菲律賓、荷蘭)、Psammotaeadiphos、Sanguinolariaacuminata(日本)、Sanguinolariadiphos(中國(guó))、Solendiphos、Solenviolaceus、Soletellinaacuminata、Soletellinaadamsii(日本)、Soletellinacumingiana、Soletellinadiphos(中國(guó)、印度)、Soletellinaradiata等，同種的眾多異名可能存在“異種”，僅憑記錄提及，缺乏確實(shí)存在的標(biāo)本證據(jù)、細(xì)節(jié)圖片或分子生態(tài)數(shù)據(jù)，難以進(jìn)一步采樣比對(duì)區(qū)分，致使對(duì)現(xiàn)有的野生種質(zhì)資源鑒定、多樣性分析等研究進(jìn)度遲緩。

南日島位于莆田市興化灣口外，地處東經(jīng)119°26′～119°34′、北緯25°09′～25°15′，是福建省第三大海島，灘涂和海域廣闊，海洋生物資源豐富，為農(nóng)業(yè)部審查通過(guò)的珍稀瀕危水生動(dòng)物——雙線紫蛤增殖放流苗種供應(yīng)單位基地，為順利開(kāi)展本地區(qū)雙線紫蛤的原種保護(hù)、自然資源恢復(fù)、規(guī)模化人工繁育、遺傳改良和可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供了有力保障。

為調(diào)研南日島雙線紫蛤自然種群的種質(zhì)情況，本研究通過(guò)測(cè)錄養(yǎng)殖和野生群體不同生長(zhǎng)時(shí)期4個(gè)貝殼形態(tài)性狀，克隆野生個(gè)體8條序列并與紫云蛤科或櫻蛤總科內(nèi)部分相關(guān)序列比較同源性和進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)行野生群體不同組織6種同工酶電泳，以分析表達(dá)活性及組織特異性，以期為今后南日島雙線紫蛤資源的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析、保護(hù)區(qū)規(guī)劃、企業(yè)和地方標(biāo)準(zhǔn)制定等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用雙線紫蛤樣本由福建省南日島海洋生物技術(shù)有限公司于2011年4月至2016年9月分批贊助提供，野生樣本隨機(jī)采捕于海區(qū)潮間帶，養(yǎng)殖樣本采集自該企業(yè)育苗養(yǎng)殖池。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)測(cè)定

雙線紫蛤樣本洗凈黏附物后，輪番輕甩數(shù)下，置于白瓷盤(pán)內(nèi)用濾紙盡量拭干殼表與外露鮮體部的殘留水漬，使用游標(biāo)卡尺和電子天平測(cè)定殼長(zhǎng)(L)、殼高(H)、殼寬(B)和個(gè)體鮮重(W)等性狀指標(biāo)。用Excel軟件處理所測(cè)量樣本各形態(tài)參數(shù)，計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差并導(dǎo)出參數(shù)間的關(guān)系式。

1.2.2 序列擴(kuò)增

雙線紫蛤樣本解剖取閉殼肌，DNA提取采用TIANGEN海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ABI Veriti PCR儀擴(kuò)增12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb、H3、18S rRNA、ITS和28S rRNA序列，產(chǎn)物回收送樣[14]。測(cè)序結(jié)果提交GenBank，核酸序列同源性采用NCBI blastn在線程序比對(duì)，Clustal X package對(duì)位，MEGA 4.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Kimura 2-parameter計(jì)算遺傳距離(bootstrap值重復(fù)1 000次)。

表1 用于南日島雙線紫蛤序列的部分有效擴(kuò)增引物

續(xù)表1

1.2.3 同工酶電泳

解剖雙線紫蛤樣本，分別稱取0.5 g閉殼肌、0.5 g斧足肌，各加入3倍體積4℃預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)冰浴勻漿，4℃抽提1.0 h，4℃離心(14 000 r/min，15 min)至上清液澄清，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳對(duì)同工酶酯酶(EST)、蘋(píng)果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)進(jìn)行分析，分離膠(pH 8.8，8.2%)和濃縮膠(pH 6.8，3.6%)制膠凝固2 h，1×Tris-Gly電泳緩沖液，上清液10 μL與等體積甘油加樣緩沖液混勻上樣，4℃電泳(90 V，40 mA，4～8 h)[14]，電泳結(jié)束浸入染液[15]染色，沖洗、脫色后拍照。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)測(cè)定

南日島雙線紫蛤群體測(cè)量的樣本總數(shù)為67枚，含養(yǎng)殖1齡貝20枚、野生2～3齡貝47枚，另觀察人工育苗的2～3月齡幼貝若干(圖1)。經(jīng)測(cè)量計(jì)算，所采樣本1齡貝的殼長(zhǎng)為3.90～5.50 cm，平均(4.61±0.45)cm；殼高為1.80～2.70 cm，平均(2.24±0.23)cm；體重為3.50～10.50 g，平均(6.32±1.79)g；殼長(zhǎng)為殼高的1.91～2.19倍，平均(2.06±0.08)倍；殼長(zhǎng)為體重的0.52～1.14倍，平均(0.77±0.16)倍；殼高為體重的0.26～0.54倍，平均(0.37±0.07)倍。2～3齡貝的殼長(zhǎng)為8.16～11.59 cm，平均(9.51±0.73)cm；殼高為3.96～5.60 cm，平均(4.60±0.36)cm；殼寬為2.01～2.36 cm，平均(2.22±0.10)cm；體重為35.70～112.20 g，平均(57.88±15.87)g；殼長(zhǎng)為殼高的1.88～2.21倍，平均(2.07±0.08)倍；殼長(zhǎng)為殼寬的3.85～4.68倍，平均(4.20±0.19)倍；殼高為殼寬的1.79～2.20倍，平均(2.03±0.09)倍；殼長(zhǎng)為體重的0.10～0.24倍，平均(0.17±0.03)倍；殼高為體重的0.05～0.11倍，平均(0.08±0.01)倍；殼寬為體重的0.03～0.05倍，平均(0.04±0.00)倍。樣本殼長(zhǎng)、殼高關(guān)系式為線性H=0.478 7L+0.042 5(R2=0.983 1)，殼長(zhǎng)、體重關(guān)系式為乘冪W=0.059 1L3.045 9(R2=0.990 2)，殼高、體重關(guān)系式為乘冪W=0.529 5H3.058 2(R2=0.993 2)，關(guān)系式R2值越高表示樣本個(gè)體間蛤殼形態(tài)的兩兩性狀之間的相關(guān)性越高。

注：A：2～3月齡貝；B：1齡貝；C：2～3齡貝。

Notes：A was 2～3 months old shellfish，B was 1 year old shellfish，C was 2～3 years old shellfish.

2.2 序列擴(kuò)增

南日島雙線紫蛤野生個(gè)體的12S rRNA(KU521370)分子量436 bp，與數(shù)據(jù)庫(kù)中同源序列JN398363(439 bp)相似性為91.8%，種內(nèi)距離為0.076 0，其中保守位點(diǎn)404個(gè)，變異位點(diǎn)31個(gè)、占7.0%，沒(méi)有簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為31.3%、28.7%、16.8%、23.2%、60.0%，A+T含量高于G+C，沒(méi)有插入位點(diǎn)，缺失位點(diǎn)5個(gè)，轉(zhuǎn)換突變的核苷酸位點(diǎn)19個(gè)，顛換突變的核苷酸位點(diǎn)12個(gè)，轉(zhuǎn)換顛換比為1.58。櫻蛤總科(Tellinoidea)12S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中雙線紫蛤KU521370(福建莆田)與JN398363(廣西北海)聚支、節(jié)點(diǎn)支持率為100%，二者與同屬紫云蛤科(Psammobiidae)血蛤?qū)?Nuttallia)的紫彩血蛤(N.olivacea)種間距離為0.300 7；同櫻蛤科(Tellinidae)白櫻蛤?qū)?Limecola)的波羅的海白櫻蛤(L.balthica)、明櫻蛤?qū)?Moerella)的彩虹明櫻蛤(M.iridescens)遺傳距離分別為0.172 9、0.185 4，與雙帶蛤科(Semelidae)雙帶蛤?qū)?Semele)的粗雙帶蛤(S.scabra)種間距離為0.335 8，與截蟶科(Solecurtidae)截蟶屬(Solecurtus)的總角截蟶(S.divaricatus)、縊蟶屬(Sinonovacula)的縊蟶(S.constricta)種間距離分別為0.195 5、0.357 8(圖2)。

16S rRNA(KM411962)分子量516 bp，與同源序列JN398363(474 bp)相似性為88.7%，種內(nèi)距離為0.121 9，保守位點(diǎn)423個(gè)，變異位點(diǎn)49個(gè)、10.3%，沒(méi)有簡(jiǎn)約信息和自裔位點(diǎn)，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為26.7%、31.1%、14.5%、27.7%、57.8%，A+T含量稍高于G+C，沒(méi)有插入位點(diǎn)，缺失位點(diǎn)5個(gè)，轉(zhuǎn)換突變位點(diǎn)30個(gè)，顛換突變位點(diǎn)19個(gè)，轉(zhuǎn)換顛換比為1.58；與疑似同種異名的亞當(dāng)斯紫蛤(S.adamsii)(日本宮崎市)序列AB751315(475 bp)相似性為99.8%，遺傳距離為0.002 2，保守位點(diǎn)474個(gè)，變異位點(diǎn)1個(gè)、占0.2%，沒(méi)有簡(jiǎn)約信息和自裔位點(diǎn)，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為26.9%、30.2%、15.1%、27.8%、57.1%，A+T含量高于G+C，沒(méi)有插入及缺失位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換突變位點(diǎn)1個(gè)。紫云蛤科16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中雙線紫蛤KM411962與JN398363沒(méi)有優(yōu)先聚支，而是與亞當(dāng)斯紫蛤聚集、節(jié)點(diǎn)支持率達(dá)100%，后與中國(guó)紫蛤(S.chinensis)群體、JN398363、綠紫蛤(S.virescens)群體聯(lián)合成一個(gè)紫蛤?qū)俅厝?，紫蛤?qū)俚逆⒚么厝河杀緦俚募庾细?S.acuta)、紫云蛤?qū)?Psammotaea)的小紫蛤(P.minor)和長(zhǎng)型紫云蛤(P.elongata)群體組成；其并簇為蒴蛤?qū)?Asaphis)的紅樹(shù)蒴蛤(A.deflorata)、對(duì)生蒴蛤(A.violascens)和地蛤?qū)?Gari)的斑紋地蛤(G.maculosa)、射線斜紋紫云蛤(G.pallida)、G.pusilla，外支為紫蛤?qū)俚腟.petalina、Sanguinolaria屬的張氏紫蛤(S.tchangsii)；血蛤?qū)俚娜毡狙?N.japonica)、紫彩血蛤群體形成了紫云蛤科16S rRNA系統(tǒng)樹(shù)的外群。南日島雙線紫蛤樣本與亞當(dāng)斯紫蛤遺傳距離最近，小于雙線紫蛤不同地理個(gè)體間的距離0.121 9；與中國(guó)紫蛤群體的平均距離為0.090 2、小于種內(nèi)距離，同綠紫蛤群體距離為0.163 7、稍大于種內(nèi)距離，與尖紫蛤距離為0.190 0，與S.petalina距離為0.232 7、為屬內(nèi)最大；而雙線紫蛤JN398363與中國(guó)紫蛤距離最近，為0.103 9，其次為亞當(dāng)斯紫蛤的0.119 2、綠紫蛤的0.143 9(圖3)。

COI(KU605621)分子量1 760 bp，KU605621與2條種內(nèi)同源序列JN859948(654 bp)、JN398363(654 bp)相似性分別為100.0%、83.2%，種內(nèi)距離分別為0.000 0、0.193 0，其中保守位點(diǎn)654個(gè)、544個(gè)，變異位點(diǎn)0個(gè)、110個(gè)，各分別占比0.0%、16.8%，沒(méi)有簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，自裔位點(diǎn)110個(gè)，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為19.0%、41.8%、15.6%、23.6%、60.8%，A+T含量高于G+C，編碼氨基酸的3個(gè)密碼子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，Pos #1堿基G的含量最高(32.1%)，堿基T的含量依次為Pos #3(52.3%)>Pos #2(45.0%)>Pos #1(28.1%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分別為19.3%、52.3%、5.2%、23.2%，沒(méi)有插入和缺失位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)67個(gè)，顛換位點(diǎn)43個(gè)，轉(zhuǎn)換顛換比1.56。紫云蛤科COI系統(tǒng)樹(shù)主要為兩個(gè)大分支，雙線紫蛤KU605621與同種的JN859948聚集、支持率為100%，卻與JN398363沒(méi)有聚支，分支也不同。系統(tǒng)樹(shù)一大分支為紫蛤?qū)?，由中?guó)紫蛤、雙線紫蛤KU605621和JN859948、綠紫蛤群體組成，其中雙線紫蛤KU605621和JN859948與中國(guó)紫蛤、綠紫蛤種間遺傳距離分別為0.168 4、0.186 2，小于與JN398363的種內(nèi)距離0.193 0；另一大分支則由紫云蛤?qū)俚拈L(zhǎng)型紫云蛤、Sanguinolaria屬的張氏紫蛤群體和蒴蛤?qū)俚募t樹(shù)蒴蛤、紫蛤?qū)俚碾p線紫蛤JN398363構(gòu)成，雙線紫蛤JN398363與紅樹(shù)蒴蛤遺傳距離最小、為0.165 8，其次是中國(guó)紫蛤的0.175 0、長(zhǎng)型紫云蛤的0.191 2，與綠紫蛤和張氏紫蛤平均距離分別為0.196 7和0.231 2；兩大分支的外支為地蛤?qū)俚陌呒y地蛤，血蛤?qū)俚淖喜恃蛉后w形成系統(tǒng)樹(shù)的外群(圖4)。

Cytb(KU568465)分子量1 216 bp，KU568465與同源序列JN398363(1 076 bp)相似性為84.4%，種內(nèi)距離為0.177 1，保守位點(diǎn)908個(gè)，變異位點(diǎn)168個(gè)、占15.6%，沒(méi)有簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)及自裔位點(diǎn)，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為23.0%、40.3%、15.4%、21.3%、63.3%，A+T含量高于G+C，編碼氨基酸的3個(gè)密碼子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，堿基T的含量均為最高，依次Pos #3(49.7%)>Pos #2(40.6%)>Pos #1(30.6%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分別為21.8%、49.7%、9.5%、19.0%，沒(méi)有插入和缺失位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換突變位點(diǎn)100個(gè)，顛換突變位點(diǎn)68個(gè)，轉(zhuǎn)換顛換比1.47。櫻蛤總科Cytb系統(tǒng)樹(shù)中雙線紫蛤KU568465與JN398363聚集、支持率為99%，再與截蟶科的總角截蟶相聚、支持率為95%，種間距離為0.219 3，后與波羅的海白櫻蛤群體和彩虹明櫻蛤組成的小支集合，外支為粗雙帶蛤和紫彩血蛤，縊蟶為外群(圖5)。

H3(KU605616-20)分子量374 bp，KU605616-20數(shù)據(jù)庫(kù)暫未檢索到種內(nèi)同源序列。櫻蛤總科H3系統(tǒng)樹(shù)中雙線紫蛤KU605616-20聚集、支持率為86%，與同科的紅樹(shù)蒴蛤、斑紋地蛤形成系統(tǒng)樹(shù)的外群，種間距離分別為0.061 4、0.055 7；斧蛤科(Donacidae)斧蛤?qū)?Donax)的截形斧蛤(D.trunculus)、長(zhǎng)條斧蛤(D.variegatus)、D.veruinus、三角斧蛤(D.deltoides)組成系統(tǒng)樹(shù)的一個(gè)獨(dú)立小支，系統(tǒng)樹(shù)的大支為混合簇，由雙帶蛤科團(tuán)結(jié)蛤?qū)?Abra)的A.prismatica、白色唱片蛤(A.alba)和光澤唱片蛤(A.nitida)、長(zhǎng)舌蛤科(Scrobiculariidae)長(zhǎng)舌蛤?qū)?Scrobicularia)的淺溝長(zhǎng)舌蛤(S.plana)、截蟶科Tagelus屬的美國(guó)截蟶(T.plebeius)、櫻蛤科Ameritella屬的多彩櫻蛤(A.versicolor)、Scissula屬的素櫻蛤(S.similis)、白櫻蛤?qū)俚牟_的海白櫻蛤聚成(圖6)。

18S rRNA(KX185515)分子量1 788 bp，KX185515暫未有種內(nèi)同源序列。紫云蛤科18S rRNA系統(tǒng)樹(shù)中雙線紫蛤KX185515與地蛤?qū)俚闹行偷馗?G.intermedia)、斑紋地蛤及紫云蛤?qū)俚拈L(zhǎng)型紫云蛤聚簇、支持率為100%，與三者種間距離均為0.001 8，外群為蒴蛤?qū)俚膶?duì)生蒴蛤、紅樹(shù)蒴蛤(圖7)。

18S-28S rRNA(KX495219-20)分子量2 534 bp，含約800 bp的18S rRNA、800 bp的28S rRNA及近900 bp的ITS區(qū)序列，KX495219-20暫無(wú)種內(nèi)同源序列。櫻蛤總科ITS區(qū)系統(tǒng)樹(shù)中雙線紫蛤KX495219-20先與同科血蛤?qū)俚哪：显聘?N.obscurata)聚簇、支持率為98%，平均種間距離為0.266 2，后與櫻蛤科的波羅的海白櫻蛤、櫻蛤(Macomanasuta)相聚，外群為截蟶科的縊蟶(圖8)。

28S rRNA(KU555423)分子量1 539 bp，KU555423暫未有種內(nèi)同源序列，與亞當(dāng)斯紫蛤序列AB746862(1 407 bp)相似性為100.0%，遺傳距離為0.000 0，保守位點(diǎn)1 407個(gè)，變異位點(diǎn)0個(gè)、占0.0%，沒(méi)有簡(jiǎn)約信息和自裔位點(diǎn)，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為20.5%、18.3%、26.9%、34.3%、38.8%，A+T含量明顯低于G+C，沒(méi)有插入、缺失位點(diǎn)。紫云蛤科28S rRNA系統(tǒng)樹(shù)為兩個(gè)分支，較大分支中雙線紫蛤KU555423與亞當(dāng)斯紫蛤、同屬的綠紫蛤先后聚支，支持率均為100%，雙線紫蛤同綠紫蛤種間距離為0.006 6，尖紫蛤與紫云蛤?qū)俚拈L(zhǎng)型紫云蛤和小紫蛤混支，大分支的外側(cè)為S.petalina；稍小分支由蒴蛤?qū)俚膶?duì)生蒴蛤、紅樹(shù)蒴蛤和地蛤?qū)俚纳渚€斜紋紫云蛤、中型地蛤、G.pusilla獨(dú)立小支匯成，系統(tǒng)樹(shù)外群為血蛤?qū)俚娜毡狙?圖9)。

2.3 同工酶電泳

南日島雙線紫蛤野生群體示例樣本的總數(shù)為15枚，染色圖譜顯示閉殼肌和斧足肌中大部分同工酶的表達(dá)調(diào)控具有組織特異性，群內(nèi)個(gè)體同組織同種酶的條帶表型、共有酶帶活性和遷移較一致。EST為正染色、酶譜較復(fù)雜，閉殼肌的酶帶數(shù)有7～8條，斧足肌有4～5條或更多，組織特異性明顯，酶位點(diǎn)活性表達(dá)強(qiáng)弱不同，樣本個(gè)體間可見(jiàn)明顯多態(tài)性；IDH為正染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有3條，組織特異性明顯，酶帶活性表達(dá)強(qiáng)弱不同，個(gè)體間未見(jiàn)多態(tài)性；LDH為正染色，閉殼肌的酶帶有1或3條，斧足肌沒(méi)有酶帶，組織特異性明顯，酶位點(diǎn)活性表達(dá)強(qiáng)弱稍有不同，個(gè)體間沒(méi)有多態(tài)性；MDH為正染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有1條，組織特異性明顯，酶位點(diǎn)活性表達(dá)強(qiáng)弱較一致，個(gè)體間未見(jiàn)多態(tài)性；ME為正染色，閉殼肌的酶帶有3或4條，斧足肌有2條，組織特異性明顯，酶位點(diǎn)活性表達(dá)強(qiáng)弱有些許不同，個(gè)體間沒(méi)有多態(tài)性；SOD為負(fù)染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有2條，組織特異性不明顯，酶位點(diǎn)活性表達(dá)強(qiáng)弱不同，個(gè)體間未見(jiàn)明顯多態(tài)性(圖10)。

注：A：酯酶(EST)；B：異檸檬酸脫氫酶(IDH)；C：乳酸脫氫酶(LDH)；D：蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)；E：蘋(píng)果酸酶(ME)；F：超氧化物歧化酶(SOD)；1：閉殼??；2：斧足肌。

Notes：A：EST；B：IDH；C：LDH；D：MDH；E：ME；F：SOD；1：Adductor muscle；2：Axe-shaped foot muscle.

3 討論

3.1 形態(tài)測(cè)定

南日島雙線紫蛤樣本的兩殼相等、呈長(zhǎng)橢圓形，殼質(zhì)薄、解剖時(shí)邊緣受外力作用時(shí)易碎，灰紫色蛤殼表被有棕黃褐色的殼皮、同心圓狀生長(zhǎng)線細(xì)密，部分2～3齡貝的殼皮延伸出蛤殼腹緣些許，喜深潛鉆穴并埋棲于潮間帶細(xì)沙內(nèi)生活，殼皮常有破損，自殼頂射出2條放射狀淺色的色帶至殼后腹緣，因殼皮伴隨著生長(zhǎng)逐漸加厚、色澤逐漸加深，使幼貝的放射條紋較成貝更易于觀察(圖1)。測(cè)定結(jié)果顯示，隨著雙線紫蛤貝齡的增加，殼長(zhǎng)、殼高、殼寬和體重參數(shù)變大，1齡貝的殼長(zhǎng)體重比(0.77±0.16)、殼高體重比(0.37±0.07)分別降低至2～3齡貝的(0.17±0.03)、(0.08±0.01)，殼長(zhǎng)殼高比相對(duì)較穩(wěn)定，生長(zhǎng)過(guò)程中未發(fā)生明顯改變，個(gè)體的體重與殼高呈現(xiàn)出最高的相關(guān)性，其次是與殼長(zhǎng)，而殼高和殼長(zhǎng)也有著一定的關(guān)聯(lián)。合浦珠母貝(Pinctadafucata)[16]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)[17]等的測(cè)定計(jì)算結(jié)果也表明，殼長(zhǎng)、殼高、殼寬3個(gè)形態(tài)性狀與體重這一質(zhì)量性狀的相關(guān)性極顯著，輻射莢蟶(Siliquaradiata)[18]殼長(zhǎng)與殼高的直線回歸關(guān)系亦較密切。同齡貝中，樣本個(gè)體間體重?cái)?shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)偏差波動(dòng)范圍較大，推測(cè)其原因除個(gè)體自身營(yíng)養(yǎng)、生理?xiàng)l件差異外，也可能是因?yàn)椴刹稌r(shí)樣本受驚雙殼突然緊閉，體內(nèi)封入了一部分海水，即使多輪甩干、濾紙吸水以求降低海水含量，但后續(xù)解剖發(fā)現(xiàn)余存海水仍未完全消除而致。樣本的同貝齡個(gè)體間無(wú)明顯形態(tài)特征差異，可能是南日島雙線紫蛤種群的分布規(guī)模仍不夠理想、遺傳背景缺乏外來(lái)基因流入、交換相對(duì)穩(wěn)定以及所處生長(zhǎng)環(huán)境較一致共同作用的結(jié)果。生物餌料投喂量和組成類(lèi)型[1]、海區(qū)底質(zhì)[2]等多方面影響雙線紫蛤存活、生長(zhǎng)與繁育，多元分析韌帶長(zhǎng)、前后緣長(zhǎng)等性狀指標(biāo)說(shuō)明北部灣海區(qū)的雙線紫蛤4個(gè)地理群體間形態(tài)參數(shù)有不同程度的判別差異[3]，表明雙線紫蛤生長(zhǎng)的環(huán)境因子不同會(huì)產(chǎn)生易區(qū)分的表型性狀差異，因此，可通過(guò)測(cè)定殼長(zhǎng)等特征性狀，分析南日島雙線紫蛤群體與其他地區(qū)自然種群同貝齡樣本的形態(tài)差異程度。

3.2 序列擴(kuò)增

南日島雙線紫蛤個(gè)體的12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb、H3、18S rRNA、ITS區(qū)和28S rRNA標(biāo)記序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的過(guò)程中，部分序列在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)暫未有種內(nèi)同源序列，紫云蛤科內(nèi)檢索到的種間同源序列條數(shù)未能滿足軟件建樹(shù)最低數(shù)量條件要求，故將該部分序列的分析比對(duì)范圍擴(kuò)大至櫻蛤總科，因此依據(jù)不同標(biāo)記序列所繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)構(gòu)不完全一致。DNA序列廣泛應(yīng)用于海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)如蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[19]、牡蠣[20-21]、縊蟶[22]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[23]、魁蚶(S.broughtonii)[24-25]、泥東風(fēng)螺(Babylonialutosa)[14]等的鑒定分類(lèi)、群體遺傳和系統(tǒng)進(jìn)化分析，根據(jù)雙線紫蛤8種序列與同源序列的聚類(lèi)結(jié)果、遺傳距離值大小、與當(dāng)前分類(lèi)階元?dú)w屬相對(duì)一致性與否，可選取COI標(biāo)記基因?qū)δ先諐u雙線紫蛤群體樣本的較多個(gè)體進(jìn)行測(cè)序，以了解本群體個(gè)體之間分子標(biāo)記是否有變異，或結(jié)合其它地理群體樣本序列分析種內(nèi)的變異情況。12S rRNA、Cytb發(fā)育樹(shù)中，產(chǎn)自南日島的雙線紫蛤序列和廣西北海的雙線紫蛤序列JN398363[13]聚在一起，但在16S rRNA、COI進(jìn)化樹(shù)中，二者的基因序列卻沒(méi)有率先聚支。紫云蛤科16S rRNA系統(tǒng)樹(shù)中，南日島雙線紫蛤與疑似同種異名的亞當(dāng)斯紫蛤[26]、同屬的中國(guó)紫蛤親緣關(guān)系更近，北海雙線紫蛤與同屬的中國(guó)紫蛤親緣關(guān)系最近，其次是亞當(dāng)斯紫蛤，種間遺傳距離值均小于不同地理位置雙線紫蛤的種內(nèi)距離；而紫云蛤科COI系統(tǒng)樹(shù)中，南日島雙線紫蛤能夠與同種的JN859948優(yōu)先聚集，且二者與中國(guó)紫蛤的進(jìn)化關(guān)系最近，其次為同屬的綠紫蛤，雙線紫蛤JN398363卻與蒴蛤?qū)俚募t樹(shù)蒴蛤具有更近的親緣關(guān)系，其次才是中國(guó)紫蛤。序列聚類(lèi)分析和遺傳距離值計(jì)算結(jié)果表明，雙線紫蛤南日島個(gè)體與廣西北海個(gè)體存在一定水平的遺傳差異，福建莆田和廣西北海的地理距離使得位于不同產(chǎn)地的雙線紫蛤基因交流遇到有效程度的阻礙，隨時(shí)間累積，逐漸穩(wěn)定形成遺傳隔離，導(dǎo)致發(fā)生明顯的遺傳變異、分化，較大的種內(nèi)遺傳距離揭示有可能存在亞種或隱存種。可在已獲得的12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb基因片段基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)長(zhǎng)片段引物擴(kuò)增、拼接南日島雙線紫蛤線粒體基因組全序列，與雙線紫蛤JN398363進(jìn)行線粒體基因組變異位點(diǎn)、堿基組成、氨基酸編碼、基因排列順序等情況做詳細(xì)的比較分析。綜合紫云蛤科16S rRNA和28S rRNA序列的種屬堿基組成、系統(tǒng)聚類(lèi)、遺傳距離處理結(jié)果來(lái)看，基因數(shù)據(jù)同前人形態(tài)分類(lèi)評(píng)價(jià)一樣，較傾向于支持紫蛤?qū)俚腟.diphos和S.adamsii為同種異名或隸屬于種的不同地理亞種，但最終分類(lèi)關(guān)系的界定尚需二者群體樣本進(jìn)化速率更快的ITS、COI、Cytb乃至線粒體基因組等的分析數(shù)據(jù)和其他高可信度的分子遺傳學(xué)資料共同佐證。

3.3 同工酶電泳

南日島雙線紫蛤群體樣本的閉殼肌和斧足肌2種組織中所檢測(cè)的5種同工酶EST、IDH、LDH、MDH和ME在酶譜表型、分布和活性上均表現(xiàn)出明顯組織特異性，可能與雙線紫蛤2種組織的特異同工酶酶系統(tǒng)、組織結(jié)構(gòu)生理功能和代謝途徑及強(qiáng)度有關(guān)，幾種同工酶的基因在閉殼肌細(xì)胞和斧足肌細(xì)胞中的調(diào)控表達(dá)不同而直接或間接表現(xiàn)出差異；個(gè)體間同一組織中IDH、LDH、MDH、ME和SOD酶系統(tǒng)譜型基本一致。EST在閉殼肌和斧足肌中皆染色出較多的酶帶、且酶譜表型相較其他幾種復(fù)雜，IDH在閉殼肌和斧足肌中酶活性均不強(qiáng)，LDH在閉殼肌中酶活性稍弱，在所用檢測(cè)條件下，6種同工酶中僅LDH在斧足肌中未顯示出酶活性或激活表達(dá)極弱、電泳后不能染出可見(jiàn)酶區(qū)帶，MDH、ME在閉殼肌中酶活性較強(qiáng)、尤其是ME酶帶染色最深，二者在斧足肌的酶活性較閉殼肌弱、酶帶顏色很淡；SOD在閉殼肌和斧足肌中都有表達(dá)、未呈現(xiàn)出明顯組織特異性和個(gè)體活性差異，2種組織間泳動(dòng)遷移較慢的負(fù)染色彌散區(qū)譜型表達(dá)具有微弱不同，但在所調(diào)整的緩沖液體系配比、增加上樣量等多輪電泳及重復(fù)染色條件下，酶活性表達(dá)均不強(qiáng)，可能與條件不適、組織生理狀態(tài)、抗氧化防御性或新陳代謝水平相關(guān)聯(lián)，酶譜部分負(fù)染色區(qū)域沒(méi)有形成清晰的條帶或界限，無(wú)法比較組織特異性或個(gè)體多態(tài)性。閉殼肌IDH、LDH、ME和斧足肌IDH、LDH酶譜中均有出現(xiàn)2條遷移較一致的負(fù)染色條帶，極個(gè)別位點(diǎn)檢測(cè)到3條負(fù)帶，在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[27]、泥東風(fēng)螺[14]等種群的遺傳變異分析中，類(lèi)似現(xiàn)象亦有發(fā)現(xiàn)，可能是由于次生酶作用或蛋白無(wú)底物脫氫反應(yīng)而產(chǎn)生的。EST、ME和SOD的個(gè)別酶帶較粗、拖尾或彌散，或許不只是單一酶帶存在，分子量相近仍需探索提高分離膠濃度、延長(zhǎng)電泳分離時(shí)間等。6種同工酶的初步電泳分析中，EST酶活性在2種組織中顯示出良好的組織特異性及個(gè)體間豐富的多態(tài)性，個(gè)體基因選擇性表達(dá)的調(diào)控不同直接體現(xiàn)在同工酶產(chǎn)物變化，這種變化反映在種群內(nèi)不同個(gè)體EST的酶帶表達(dá)增強(qiáng)或減弱而造成的條帶有無(wú)、活性強(qiáng)弱或數(shù)目差異，但共有酶帶泳動(dòng)遷移位置未發(fā)生改變，表明南日島雙線紫蛤個(gè)體之間的遺傳分化因海區(qū)同質(zhì)化環(huán)境和基因有效交流作用變異程度不是很高；EST的編碼位點(diǎn)較多，酶譜表型穩(wěn)定重復(fù)性好，適于進(jìn)一步研究南日島雙線紫蛤群體內(nèi)同工酶多態(tài)性位點(diǎn)有無(wú)、多寡比例等指標(biāo)，是進(jìn)一步評(píng)價(jià)分析多種組織、不同貝齡、揭示群內(nèi)個(gè)體或異地種群間遺傳差異的理想工具酶。

致謝：實(shí)驗(yàn)得到中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室茅云翔教授、福建省水產(chǎn)研究所福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾志南研究員及福建省南日島海洋生物技術(shù)有限公司陳珍賜先生的諸多支持，特此致謝。

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