不同來源腐植酸紅外光譜的比較研究

魏世平 吳 萌 李忠佩

中國科學(xué)院南京土壤研究所 南京 210008

腐殖質(zhì)是自然界中分布最廣泛的有機物，常存在于煤炭、土壤、水體、底泥等介質(zhì)中[1]。大量研究表明腐植酸是腐殖質(zhì)中的活性物質(zhì)，在土壤肥力提升和環(huán)境污染修復(fù)方面具有重要作用[2～4]。將腐植酸作為生物指標(biāo)在生態(tài)功能方面的研究相對較少，而腐植酸的生物學(xué)作用最終被歸因于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，特別是官能團和元素組成的屬性[5]，所以研究腐植酸的結(jié)構(gòu)對于了解腐植酸的功能化學(xué)屬性意義重大。

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）作為一種分子吸收光譜，可以對有機物中含氧官能團進行無損測定，故被評定為有機物定性鑒定與半定量分析的一種實用技術(shù)[6～8]。目前，利用紅外光譜技術(shù)對褐煤和泥炭HA的研究較多[9，10]，而對來源于秸稈堆肥以及湖泊底泥HA的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究相對較少，特別是對他們之間HA化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異比較研究更少。

本研究選擇了差異較大的褐煤、腐熟秸稈、泥炭和底泥4種材料，通過對其基本元素的測定以及含氧官能團的紅外光譜分析，從而對HA的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行比較研究，進而更深入地了解HA的化學(xué)組成，旨在為HA的生物活性利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源及HA的提取

供試材料包括褐煤、腐熟秸稈、底泥和泥炭。

褐煤購自中國內(nèi)蒙古自治區(qū)烏海市同升商貿(mào)有限責(zé)任公司；腐熟秸稈來自水稻秸稈的腐熟堆肥，其腐解過程為：添加尿素將破碎后的秸稈碳氮比調(diào)節(jié)至50，再添加適量的已活化EM菌液（秸稈發(fā)酵菌劑），28 ℃培養(yǎng)，直至腐熟，堆肥時間為1個月；底泥采自中國鎮(zhèn)江太湖湖心位置，采樣坐標(biāo)為31°27′N，120°01′E，湖底表層40 cm以下土樣；泥炭來自印尼，屬于木本泥炭。所有樣品經(jīng)風(fēng)干后，過60目篩備用。

根據(jù)HA在酸堿中溶解度的不同，HA的提取方法如下[11，12]：用0.1 M的Na4P2O7-NaOH浸提液提取，固液比為1∶10，振蕩過濾后，保留溶液；用6 M HCl將溶液的pH值調(diào)至1，保留沉淀，再用0.1 M NaOH重復(fù)溶解沉淀，再次用HCl將溶液的pH值調(diào)至1，保留沉淀；用0.3 M HF和純水分別沖洗2次，保留HA沉淀，裝入透析袋，在蒸餾水中透析，直至用AgNO3檢測不出Cl-為止；透析后的沉淀經(jīng)﹣45 ℃冷凍干燥96 h后，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 碳氮含量以及紅外圖譜的測定方法

碳、氮元素的含量分析是由德國ELEMENTAR vario MACRO機器完成測定，上樣量為20 mg，每種材料HA至少測定2個平行。測量時氧化管和還原管的溫度分別設(shè)置為1150 ℃和850 ℃。

材料HA的紅外光譜是由美國Thermo Scientif i c Nicolet iS10紅外光譜儀檢測并采集4000～400 cm-1范圍的圖譜而來。稱取2 mg樣品，每個樣品測定3個平行，按照1∶100添加干燥的溴化鉀粉末，壓片后進行上機檢測，具體方法參考Wu等[12]研究。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

HA紅外圖譜用OMNIC軟件對吸光度曲線進行標(biāo)準(zhǔn)化后進行峰面積積分處理分析；為了更好地比較材料HA之間芳香化合物的相對含量和脂族化程度的相對高低，引入Iar、2920/1710、2920/1600和2920/2850 4種衡量指標(biāo)[12，13]，計算公式如下：

Iar= 1600 cm-1處峰面積/（2920 cm-1處峰面積+2850 cm-1處峰面積）；

2920/1710=（2920 cm-1處 峰 面 積 +2850 cm-1處峰面積）/1710 cm-1處峰面積；

2920/1600=（2920 cm-1處 峰 面 積 +2850 cm-1處峰面積）/1600 cm-1處峰面積；

2920/2850=2920 cm-1處峰面積/2850 cm-1處峰面積。

不同材料HA相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)間的方差分析及多重比較由SPSS 16.0來完成；相關(guān)數(shù)據(jù)圖片用Origin 8.0進行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳氮含量的測定結(jié)果與分析

所選材料HA的碳、氮元素含量見表1。從不同材料中提取出的HA在含碳量、含氮量、碳/氮上存在顯著差異。泥炭HA含碳量最高，為57.36%，顯著高于其他材料HA。只有腐熟秸稈HA含碳量顯著小于其他材料，為49.28%。腐熟秸稈和底泥的HA含氮量顯著大于褐煤和泥炭HA，并且底泥HA的含氮量達到泥炭HA的5倍多，為5.02%；泥炭和褐煤的HA碳氮比顯著高于腐熟秸稈HA和底泥HA，其中泥炭HA的碳氮比約為腐熟秸稈HA的6倍，為69.32。

4種材料HA中，由于泥炭HA的含碳量最高而含氮量最低，所以導(dǎo)致泥炭HA碳氮比最大。與前人的研究結(jié)果相比，從內(nèi)蒙褐煤中提取純化的HA，與Dong等[14]研究中同樣來自內(nèi)蒙的褐煤和李鵬[9]研究中所用褐煤（來自湖南）其碳氮含量相當(dāng)，但是在Peuravuori等[15]關(guān)于褐煤HA結(jié)構(gòu)特性的研究中，HA含碳量為607～641 g/kg，要高于本研究所用褐煤材料。在Yarkova等[16]關(guān)于泥炭HA結(jié)構(gòu)研究中，泥炭HA的含碳量與本試驗研究結(jié)果相似，而含氮量是本研究的3倍。本研究的底泥來自太湖，由于沒有關(guān)于同一采樣來源的類似研究，所以在碳氮含量上無法比較。

表1 不同材料HA碳、氮元素含量Tab.1 The carbon and nitrogen content of humic acid from diあerent materials

2.2 紅外圖譜的結(jié)果與分析

材料HA的紅外光譜圖見圖1，圖中標(biāo)出13種不同波數(shù)的吸收峰。在4種HA中共同檢測到的吸收峰有6處，分別為：代表OH基團伸展的3400 cm-1處，代表脂肪族CH2不對稱、對稱的C-H伸展的2920 cm-1、2850 cm-1處，代表COOH中C=O伸展的1710 cm-1處，代表芳香族C=C骨架振動的1600 cm-1處，以及代表COOH基團的C-O伸縮和O-H變形、芳香醚和苯酚的C-O伸展的1240 cm-1處。其余7處吸收峰只在部分材料HA的紅外圖譜中出現(xiàn)：如代表酚羥基的O-H變形和C-O伸展的1420 cm-1處，只在腐熟秸稈和泥炭HA中出現(xiàn)；代表多糖和類多糖的C-O伸展的1030 cm-1處，只在腐熟秸稈和底泥HA中出現(xiàn)。另外，腐熟秸稈HA中還檢測到4處獨有的吸收峰，分別為：代表酰胺C=O伸展的1660 cm-1處，代表芳香族C=C伸展的1510 cm-1處，代表脂肪族的C-H變形的1455 cm-1處，以及代表醇和醚基團的C-O伸展的1125 cm-1處。但是腐熟秸稈HA卻是唯一沒有檢測到1380 cm-1處吸收峰的材料，1380 cm-1所代表的官能團為芳香族CH2和CH3的C-H變形或 COO-基團的反對稱伸縮[12，17，18]。

計算各材料HA相應(yīng)吸收峰的峰面積，各峰面積的相對比例列于表2，從峰面積的相對比例上可以看出，不同來源HA在不同吸收峰處的相對強度不同，表明不同物料HA在含氧官能團或結(jié)構(gòu)單元上存在數(shù)量上的差異[19]。其中，褐煤HA含有最多的羧基（1710 cm-1）；腐熟秸稈HA的吸收峰最豐富，表明新形成的秸稈HA所含有的酰胺類、醇類、酚類、多糖等化合物較多；底泥HA在1710 cm-1處的峰面積比例較小，而在1240 cm-1處峰面積比例最大，表明其中芳香醚和苯酚的含量最多；泥炭HA的芳香族C=C骨架振動（1600 cm-1）最明顯，表明其組成中芳香族化合物含量較多。

圖1 不同材料HA的紅外光譜Fig.1 Infrared spectroscopy of humic acid from diあerent materials

表2 不同材料HA紅外圖譜吸收峰波數(shù)以及峰面積的相對比例Tab.2 Infrared spectroscopy absorption peak wave number and the peak area relative proportion of humic acid from diあerent materials

4種材料HA的Iar值繪于圖2，根據(jù)Wu等[12]關(guān)于不同連作年限土壤HA紅外結(jié)構(gòu)與其抑菌活性的關(guān)系研究，將Iar用于描述材料HA中芳香化合物的相對含量。圖2中褐煤HA的Iar最高，為10.02；泥炭HA次之，為7.16；腐熟秸稈HA最低，為0.08。方差分析結(jié)果表明，4種HA的Iar值存在顯著性差異，表明褐煤HA芳香化合物的相對含量顯著高于泥炭HA、底泥HA和腐熟秸稈HA，而腐熟秸稈HA中芳香化合物含量在4種材料中最低 [9，15，16，20，21]。

圖2 不同材料HA的Iar值Fig.2 Iar of HA from diあerent materials

圖3描繪的是4種材料HA與脂族性相關(guān)的參數(shù)。2920/1710、2920/1600可以用來表示化合物分子結(jié)構(gòu)的脂族化，2920/2850表示的是脂族鏈烴中聚亞甲基碳和末端甲基碳的比例，可以用來反映脂族鏈的長短或分支情況[13]。

圖3 不同材料HA的脂族性參數(shù)Fig.3 Aliphatic parameter of HA from diあerent materials

圖3 顯示腐熟秸稈HA 2920/1710、2920/1600和2920/2850的比值均顯著高于其他材料，分別為3.77、12.05、15.15，表明腐熟秸稈HA的脂族化程度最高，同時說明其脂族鏈相對較長或分支相對較多。這與肖燏杰[6]關(guān)于水稻秸稈腐解產(chǎn)生溶解性有機質(zhì)的分組組成的研究結(jié)果一致，其研究中發(fā)現(xiàn)疏水中性的HA除了含有較多的脂族類烷烴，還有少量酰胺類、芳香族不飽和物質(zhì)和碳水化合物。褐煤HA和泥炭HA的2920/1710、2920/1600比值最低，分別為0.21、0.10和0.39、0.14，表明他們的脂族化程度最低，這與Iar分析的結(jié)果一致。雖然泥炭HA的2920/1710、2920/1600比值較低，但是2920/2850比值與腐熟秸稈HA沒有差異（P＜0.05），為14.71，表明其所含較少的脂肪族化合物中可能擁有最長的脂族鏈或最多的分支。

3 結(jié)論

通過對4種材料HA的元素組成和含氧官能團進行研究分析得到：

（1）泥炭HA和褐煤HA具有較高的含碳量和較低的含氮量，故其碳氮比相對較高；而腐熟秸稈HA和底泥HA的含碳量和含氮量具有相反的趨勢，故碳氮比相對較低。

（2）褐煤HA和泥炭HA的結(jié)構(gòu)中芳香族化合物含量相對較高、脂族化程度相對較低，而腐熟秸稈HA和底泥HA中芳香族化合物含量相對較低、脂族化程度相對較高。

（3）腐熟秸稈HA脂族化程度最高，同時腐熟秸稈HA和泥炭HA中所含有的脂族鏈相對較長或分支相對較多。

在此基礎(chǔ)上，還需進一步研究4種材料HA的實際改良效果，包括作為土壤調(diào)理劑、穩(wěn)定劑，盆栽土壤的組成，顆粒肥料的組成，懸浮液體肥料添加劑，以及對植物生長作用的研究等，從而拓展其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上新的應(yīng)用領(lǐng)域。

[ 1 ]徐麗娜. 厭氧條件下腐殖酸對Fe（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的微生物還原的影響[D]. 中國科學(xué)院南京土壤研究所碩士學(xué)位論文，2008.

[ 2 ]Plaza C, Senesi N. The effect of organic matter amendment on native soil humic substances[M]//Nicola S, Xing B S, Huang P M. Biophysicochemical processes involving natural nonliving organic matter in environmental systems. John Wiley & Sons, 2009: 147～181.

[ 3 ]楊瑞吉，楊祁峰，?？×x. 表征土壤肥力主要指標(biāo)的研究進展[J]. 甘肅農(nóng)大學(xué)報，2004，39（1）：86～91.

[ 4 ]李忠佩，徐麗娜，車玉萍. 溶液培養(yǎng)條件下腐殖酸對Cr（Ⅵ）微生物還原的影響[J]. 土壤，2015，47（2）：356～360.

[ 5 ]Loffredo E, Berloco M, Casulli F, et al. In vitro assessment of the inhibiton of humic substances on the growth of two strains of Fusarium oxysporum[J]. Biology and Fertility of Soils,2007, 43(6): 759～769.

[ 6 ]肖燏杰. 水稻秸稈腐解產(chǎn)生溶解性有機質(zhì)的分組組成及其環(huán)境意義[D]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009.

[ 7 ]Giovanela M, Crespo J S, Antunes M, et al.Chemical and spectroscopic characterization of humic acids extracted from the bottom sediments of a Brazilian subtropical microbasin[J].Journal of Molecular Structure, 2010, 981(1):111～119.

[ 8 ]Qu X X, Xie L, Lin Y, et al. Quantitative and qualitative characteristics of dissolved organic matter from eight dominant aquatic macrophytes in Lake Dianchi, China[J]. Environ. Sci. pollut.Res., 2013, 20(10): 7413～7423.

[ 9 ]李鵬. 褐煤胡敏酸與天然鐵、鈦、硅氧化礦物的吸附研究[D]. 中南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012.

[ 10 ]Heller C, Ellerbrock R H, Rosskopf N, et al.Soil organic matter characterization of temperate peatland soil with FTIR-spectroscopy: eあects of mire type and drainage intensity[J]. European Journal of Soil Science. 2015, 66(5): 847～858.

[ 11 ]斯蒂文森. 腐殖質(zhì)化學(xué)[M]. 北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1994.

[ 12 ]Wu M, Song M Y, Liu M, et al. Fungicidal activities of soil humic/fulvic acids as related to their chemical structures in greenhouse vegetable fields with cultivation chronosequence[J].Scienti fi c Reports, 2016(6): 32858.

[ 13 ]肖彥春，竇森. 土壤腐殖質(zhì)各組分紅外光譜研究 [J]. 分析化學(xué)，2007，35（11）：1596～1600.

[ 14 ]Dong L H, Yang J S, Yuan H L, et al. Chemical characteristics and influences of two fractions of Chinese lignite humic acids on urease[J].European Journal of Soil Bilology, 2008, 44(2):166～171.

[ 15 ]Peuravuori J, ?bánková P, Pihlaja K. Aspects of structural features in lignite and lignite humic acids[J]. Fuel Processing Technology, 2006,87(9): 829～839.

[ 16 ]Yarkova T A, Gyul’maliev A M. Average structural model of humic acids of peat origin[J].Solid Fuel Chemistry, 2012, 46(5): 279～281.

[ 17 ]竇森. 土壤有機質(zhì)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2010.

[ 18 ]Monda H, Cozzolino V, Vinci G, et al. Molecular characteristic of water-extractable organic matter from different composted biomasses and their effects on seed germination and early growth of maize[J]. Science of the Total Environment,2017, 590～591: 40～49.

[ 19 ]竇森，姜巖. 土壤施用有機物料后重組有機質(zhì)變化規(guī)律的探討——Ⅱ.對重組有機質(zhì)中腐殖質(zhì)組成和胡敏酸光學(xué)性質(zhì)的影響[J]. 土壤學(xué)報，1988，25（3）：252～261.

[ 20 ]竇森，陳恩鳳，譚世文，等. 不同來源胡敏酸的結(jié)構(gòu)表征[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1989，11（2）：50～56.

[ 21 ]徐麗娜，李忠佩，車玉萍. 淹水厭氧條件下腐殖酸對紅壤中鐵異化還原過程的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2009，30（1）：221～226.