活載體疫苗的研究進展

馬俊飛， 丁承超， 謝曼曼， 曾海娟， 郭 亮， 汪冠豪， 劉 箐

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院,上海 200093)

疫苗在動物疫病和人類傳染病的預防和治療中發(fā)揮著巨大作用，傳統(tǒng)疫苗(滅活苗、弱毒苗)顯露出免疫效果差、安全性低等諸多的局限性，已經不足以應對當今新疾病泛濫的嚴峻形勢。DNA重組技術的發(fā)展，為疫苗技術的突破帶來了新的機遇，形成了包括重組亞單位疫苗、活載體疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和轉基因植物疫苗在內的一類新型疫苗——基因工程疫苗。其中，活載體疫苗是最具有發(fā)展意義的疫苗類型之一?；钶d體疫苗是將有效的目的抗原的編碼基因通過分子生物學手段導入活載體(無或弱毒的細菌或病毒)，構建重組菌(毒)株，使目的基因隨著重組菌(毒)株在宿主體內的增殖而大量表達，從而誘發(fā)相應的免疫保護應答?；钶d體疫苗可誘導動物產生體液免疫和細胞免疫，甚至黏膜免疫，具有免疫效果好、成本低、穩(wěn)定性好、誘導位點專一、免疫方式簡單等優(yōu)點，成為今后疫苗的主要發(fā)展方向之一。細菌、病毒等微生物本身能夠入侵并啟動宿主免疫系統(tǒng)。有研究顯示，微生物疫苗載體在腫瘤控制中有良好的靶向性和控制力，甚至發(fā)現(xiàn)某些病原微生物偏向于入侵腫瘤組織[1]。不僅如此，微生物載體疫苗在動物疫病與人類復雜疾病方面的研究也成為當前疫苗研究的重要方向。根據(jù)已開發(fā)的微生物載體類型，可將活載體疫苗分為兩類：細菌活載體疫苗與病毒活載體疫苗?，F(xiàn)就兩種疫苗載體、抗原呈遞策略和疫苗免疫效果等予以介紹。

1 細菌活載體疫苗

將病原體的保護性抗原或表位的編碼基因插入到細菌基因組或質粒中，并使其順利表達而獲得的重組菌株就是細菌活載體疫苗。根據(jù)使用的細菌載體毒性，將細菌載體分為減毒致病菌與非致病菌兩類。

1.1 減毒致病菌活載體疫苗

早期應用于疫苗載體的致病菌主要通過化學物質誘變的方法減毒，但是這種減毒方法存在明顯的缺陷：如毒力不穩(wěn)定、減毒具有盲目性和隨機性，且可能存在其他未知突變、毒力回復性強等問題[2]，難以達到疫苗安全性的要求。隨著分子生物學技術的發(fā)展，近年來研究者多采用基因工程技術敲除致病菌毒力基因的方法來構建減毒菌株，敲除毒力基因是一種比常規(guī)致弱手段更安全的減毒方法。利用基因工程技術在致病菌染色體基因組上敲除一段或幾段基因，以改變其編碼毒力因子的基因序列，或改變編碼關鍵代謝途徑的酶基因序列，以及插入轉座子改變臨近基因的功能[3]等均可使其減毒，但仍能使其保留高度的免疫原性。

1.1.1 減毒沙門氏菌活載體疫苗 沙門氏菌(Salmonellaspp.)，屬于革蘭陰性桿菌，目前應用于疫苗載體的沙門氏菌主要是鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。通過基因工程技術，敲除aro、cya/crp、dam、phoP/phoQ、asd等毒力基因，均可得到沙門氏菌的減毒株。減毒后的沙門氏菌仍然具有良好的侵襲力，其入侵機制有入侵黏膜上皮微皺褶細胞(M細胞)或樹突細胞(Dendritic Cell, DC)攝取兩種途徑。M細胞可將抗原物質轉運到誘導位點，從而產生由淋巴細胞介導的初級免疫應答。減毒沙門氏菌由M細胞轉運到腸黏膜相關淋巴組織(Gut-Associated Lymphoid Tissue, GALT)，激活Th2細胞產生IL-5，活化B細胞分化為漿細胞，使其產生分泌型IgA(SIgA)，SIgA在黏膜免疫中起重要作用[4]。DC作為抗原遞呈細胞，在啟動獲得性免疫中起重要作用，能夠加工沙門氏菌并遞呈源自沙門氏菌編碼抗原的短肽并與其表達的MHCⅡ類產物結合，進而結合并刺激CD4+和CD8+T細胞產生細胞和體液免疫[5]。減毒沙門氏菌載體疫苗免疫簡單易行，可采用口服或滴鼻等非注射方式，不但能夠誘導目標抗原的免疫應答，同時減毒的沙門氏菌也能誘導相應的免疫應答，可用于生產多價疫苗，應用前景廣闊。

近年來，基于沙門氏菌的活載體疫苗的應用已經很廣泛。①針對病毒靶標方面，Cong等[6]選用減毒沙門氏菌C500株作為載體構建了攜帶重組質粒p3D-NT56/S的重組疫苗，該質粒插入口蹄疫抗原基因3D基因，將該重組疫苗進行動物免疫實驗起到了很好的免疫效果；②針對細菌靶標方面，Wang等[7]將表達結核桿菌抗原基因Ag85B、ESAT6-Ag85B的重組質粒pV-85B、pV-E6-85B電轉化到減毒沙門氏菌株aroA SL7207中構建減毒重組菌株SL(85B)與SL(E6-85B)，誘導小鼠產生高效免疫應答；③針對寄生蟲靶標方面，Qu等[8]將編碼鼠弓形蟲的表面抗原蛋白SAG1的真核表達質粒轉入減毒沙門氏菌株ZJ111中，接種小鼠后成功誘導Th1型免疫應答；④針對腫瘤方面，Manuel等[9]構建的導入CO-SVN基因的重組沙門氏菌3342Max能正常表達SVN蛋白以減慢鼠類黑素瘤的生長速度。

1.1.2 減毒單核細胞增生李斯特氏菌活載體疫苗 單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogen-es,Lm)是一種革蘭陽性菌，具有典型的胞內寄生和胞間傳遞等特性。Lm的毒力基因主要由prfA、plcA、plcB、hly、mpl、actA等組成，通過敲除以上毒力基因，研究者已構建了大量的缺失突變株，但一些突變株的毒力降低效果并不顯著[10]。毒力基因雙重敲除的方式能夠更好地確保疫苗的安全性，如Brockstedt等[11]構建的actA/inIB毒力基因雙重敲除的突變株在保持原有免疫原性的前提下毒性減弱了1 000倍以上。Lm經減毒后作為疫苗載體，能夠引起MHCⅠ抗原呈遞系統(tǒng)，刺激CD8+和CD4+T細胞產生相應的細胞免疫，且主要是特異性激發(fā)CD8+T細胞[12]。Lm作為口服疫苗載體，可產生相應的黏膜免疫，能穿過腸道屏障進入血液循環(huán)遠程呈遞抗原[13]，成為口服疫苗研發(fā)的最佳選擇之一。

目前，以減毒Lm作為活載體的疫苗研究主要集中于抗病毒、抗腫瘤領域，如人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)、轉移性胰腺癌等[14-15]。Maciag等[16]構建的以減毒Lm為活載體的疫苗菌株Lm-LLO-E7已成功應用于治療晚期宮頸癌的臨床實驗中。

使用減毒致病菌作為疫苗載體已成為當今疫苗研究的一大熱點。迄今為止，已開發(fā)的可作為疫苗載體的細菌除上述外，還有其他一些減毒致病菌也應用到疫苗載體的研究中：如Ruan等[17]以大腸埃希菌為載體構建了表達融合抗原1FaeG-FedF-LT192A2：5LTB的重組菌株，口服免疫仔豬產生了相應的特異性免疫應答；Hiroi等[18]以減毒牛型分枝桿菌作為疫苗載體構建的重組卡介苗rBCG-V3J1，成功表達了針對艾滋病的保護性抗原V3；Brzu等[19]以減毒志賀氏菌CVD1203作為載體成功表達了大腸埃希菌熱不穩(wěn)定毒素的B亞單位(LT-B)及腸毒素大腸埃希菌的定殖因子抗原CFA/1和CS3。隨著生物信息學與基因工程技術的發(fā)展，將會有更多的減毒致病菌種應用到疫苗載體的研究中去。

1.2 非致病菌活載體疫苗

隨著減毒致病菌活載體疫苗研究的深入，其缺點也逐漸顯現(xiàn)，比如保留的侵襲性和毒性會使其在免疫缺陷者與兒童的免疫應用中受到限制[20]。眾多研究表明，盡管使用的致病菌載體是經過減毒的，但其仍保留微弱的毒性，而且還存在著毒力返強的突變風險。此外，革蘭陰性菌分泌的脂多糖可能會對宿主細胞有毒性，還可能干擾編碼基因在宿主細胞內的轉錄與表達[21]。因此，非致病菌相較于致病菌在用作疫苗載體時有其獨特的優(yōu)勢。

乳酸菌(Lacticacidbacteria, LAB)屬于革蘭陽性菌，是存在于人類與動物腸道中被認定為安全級(Generally Regarded As Safe, GRAS)的有益菌；一些乳酸菌還具有免疫修飾作用，可以作為激活宿主免疫系統(tǒng)的佐劑，調節(jié)機體的免疫水平和提高抗原的免疫原性[22]；以乳酸菌為載體的疫苗生產工藝簡單，可以通過滴鼻或口服等非注射方式免疫，使用方便。這些優(yōu)勢使乳酸菌成為疫苗載體的更好選擇。乳酸菌表達外源抗原主要有細胞內表達、細胞外分泌、細胞壁錨定三種方式。研究比較以上三種方式并評估其免疫效果發(fā)現(xiàn)，用細胞壁錨定將抗原暴露在宿主細胞表面能夠獲得最為強烈的免疫應答[20,23]。目前，乳酸菌作為疫苗載體已成功表達了禽流感H5N1亞型病毒[24]、腸毒性大腸埃希菌[25]、利什曼蟲[26]等的保護性抗原，在對預防與治療由病毒、細菌及寄生蟲引起的疾病方面具有良好的研究價值。此外，乳酸菌還是在黏膜水平上傳遞細胞因子的理想載體，使用乳酸菌在黏膜水平傳遞動物細胞因子的研究已經非常廣泛，如Bermúdezhumarán等[27]構建的表達IL-10細胞因子的重組乳酸菌能夠預防或減輕人類結腸炎疾病，并且該重組菌株作為免疫制劑已經通過了一期臨床實驗。

2 病毒活載體疫苗

病毒活載體疫苗，是指將外源抗原的編碼基因插入到弱毒力的病毒載體基因組的非必需區(qū)中并使之順利表達而獲得的重組病毒。目前已用作疫苗載體的病毒種類范圍非常廣泛，從DNA病毒如痘病毒、腺病毒、皰疹病毒[28-30]到RNA病毒如新城疫病毒、脊髓灰質炎病毒、流感病毒[31-33]等。通過缺失、突變病毒的非必需區(qū)基因或直接在病毒的基因組內插入能使病毒減毒的基因的方法都可以使病毒的毒力減小，但同時又不會影響其自身的免疫原性和繁殖特性，從而使其具有一定的可作為疫苗載體的安全性。此外，雖然有些病毒本身不能在哺乳動物細胞中復制，但能感染哺乳動物細胞并表達外源抗原，將抗原提呈給宿主免疫系統(tǒng)，引起相應的免疫應答，如禽痘病毒及金絲雀痘病毒等[34]。一般DNA病毒的基因組容量都較大，非必需區(qū)基因組有較多的可插入外源基因的位點。作為疫苗的重組DNA病毒的構建一般采用同源重組的方法：將攜帶外源基因的轉移載體質粒與全病毒DNA共轉染細胞，通過基因重組將外源基因導入病毒基因組的特定部分，如Han等[35]將PRV Bartha-K61株基因組DNA與構建的質粒pUL21-SRV9G-EGFP進行了同源重組。而RNA病毒的基因組都較小，對外源基因的容量也很小。構建RNA病毒載體要先將病毒RNA基因組反轉錄成cDNA分子，將cDNA分子插入外源基因后克隆到質粒中，在合適的啟動子控制下轉錄成RNA分子，然后轉錄的RNA分子轉染細胞即可得到重組RNA病毒載體疫苗，如以脊髓灰質炎病毒為載體的艾滋病疫苗[36]，以新城疫病毒為載體表達雞傳染性喉氣管炎病毒的糖蛋白gD的禽類疫苗[37]等。

目前，病毒活載體疫苗的研究已經廣泛地涉及漁業(yè)、畜牧業(yè)的各種動物疫病及人類的復雜疾病中，但由于其安全性還未得到長期可靠的驗證，距離臨床應用還有一定的距離。以痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、脊髓灰質炎病毒等為載體的疫苗還能夠通過黏膜途徑引發(fā)黏膜免疫應答，顯示出巨大的應用潛力。

3 活載體疫苗抗原呈遞策略

對于活載體疫苗而言，尋找合適的載體很重要。合適的載體能夠穩(wěn)定地表達外源抗原并將其呈遞到恰當?shù)牟课?，刺激機體免疫系統(tǒng)產生相應的免疫反應。此外，不同的抗原呈遞策略也會影響到疫苗的免疫效果與安全性。活載體疫苗常用的抗原呈遞策略有載體-宿主平衡致死系統(tǒng)(vector-host balanced lethal system)、微生物表面展示系統(tǒng)等。

3.1 載體-宿主平衡致死系統(tǒng)

在構建表達外源保護性抗原的減毒微生物載體時，通常將編碼外源抗原的基因片段克隆在含抗藥基因的載體上，以抗生素作為標記來維持質粒的穩(wěn)定性。但是，抗原表達系統(tǒng)中存在的抗生素殘留會導致抗生素污染等安全性問題，還會引起質粒丟失造成免疫效果下降[38-39]。所以美國食品與藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)規(guī)定，活疫苗中不能存在抗藥質粒，并且在人和動物體內，無法用抗生素來維持重組質粒的穩(wěn)定性。載體-宿主平衡致死系統(tǒng)的構建避免了抗生素帶來的負面問題。

構建載體-宿主平衡致死系統(tǒng)，首先要使宿主菌株缺失編碼對菌株生長繁殖所必需產物的管家基因，管家基因的缺失會導致細菌不能合成某種必需的營養(yǎng)物質而死亡，該營養(yǎng)缺陷型的菌株必須在添加相應營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基上生長。導入帶有其互補基因的質粒與基因缺失菌株構成平衡致死系統(tǒng)后，才能在基本培養(yǎng)基上生長。該系統(tǒng)以營養(yǎng)選擇標志代替抗生素抗性標志，使外源基因在宿主菌內穩(wěn)定表達，有效地解決了減毒活載體疫苗使用中的抗生素污染問題。管家基因一般為編碼芳香族氨基酸、胸腺嘧啶、二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)等營養(yǎng)物質的基因片段，用于營養(yǎng)缺陷型菌株的構建。如asd基因編碼天門冬氨酸-β-半醛脫氫酶，該酶在DAP代謝中起重要作用。而DAP是構成革蘭陰性菌細胞壁上肽聚糖的基本成分，缺少DAP將造成細菌的裂解死亡。Yan等[40]使用缺失asdB基因的E.tarda菌株與插入asdB基因的載體質粒構建了平衡致死的重組菌株WED△asdB/pUTta4DGap，用來表達魚病原體嗜水氣單胞菌LSA34的保護性抗原基因gapA34。基于營養(yǎng)缺陷型基因構建的平衡致死系統(tǒng)已被證明是替代抗生素的選擇標記并增強抗原表達穩(wěn)定性的有效工具。目前，平衡致死系統(tǒng)已經成功應用于開發(fā)沙門氏菌、大腸埃希菌、單核細胞增生李斯特氏菌、牛分枝桿菌等多價疫苗中[41-44]。

3.2 微生物表面展示系統(tǒng)

外源抗原基因隨載體進入宿主體內后的表達量不足嚴重影響著活載體疫苗的免疫效果。目前普遍認為在微生物載體表面表達外源抗原是活載體疫苗抗原呈遞的最佳方式，因此基于錨定重組蛋白到微生物表面的策略得到了越來越多的關注[45]。微生物表面展示系統(tǒng)，就是通過外源抗原蛋白與載體上一定的錨定蛋白融合連接，導入微生物宿主細胞中，從而將外源抗原表達并定位在微生物表面的抗原呈遞系統(tǒng)。在疫苗研究領域，應用的微生物表面展示系統(tǒng)主要包括細菌表面展示系統(tǒng)與桿狀病毒表面展示系統(tǒng)。

3.2.1 細菌表面展示系統(tǒng) 自噬菌體表面展示技術被開發(fā)以來，細菌表面展示技術也得到了飛速發(fā)展。細菌表面的錨定蛋白可以是細菌的外膜蛋白、菌毛蛋白與鞭毛蛋白等。外源抗原重組蛋白可以通過跨膜結構域錨定、脂蛋白錨定、基于LPXTG基序的共價連接與基于LysM或Wxl基序的非共價連接方式等與細菌表面蛋白錨定連接，且外源蛋白表達的穩(wěn)定性和功能性與所采取的錨定方式有關[45-46]。由于革蘭陰性菌與革蘭陽性菌的結構不同，其作為載體在細菌表面展示系統(tǒng)中的應用也不同。一般認為革蘭陰性菌遺傳背景清楚，便于構建重組蛋白的表面展示，而革蘭陽性菌胞膜外的細胞壁厚而堅韌，膜蛋白難以表露，因此不適合表面呈現(xiàn)。但已有研究成功構建了革蘭陽性菌的表面展示系統(tǒng)，如Audouy等[47]以細菌表面展示技術構建的革蘭陽性增強基質系統(tǒng)(Gram-positive Enhancer Matrix, GEM)，以乳酸乳球菌為疫苗載體成功表達了肺炎球菌的保護性抗原。目前，細菌表面展示系統(tǒng)已成功地應用于沙門氏菌、枯草芽胞桿菌、嗜水氣單胞菌等為載體的疫苗設計中[48-50]，顯示出重要的研究價值及廣闊的應用前景。同時，細菌表面展示系統(tǒng)仍然存在一些不足：作為表面展示系統(tǒng)的細菌表面展示外源蛋白的能力是有限的，且插入含帶電荷殘基或疏水殘基的氨基酸序列會導致外源蛋白的分泌不足，此外，對于宿主菌遺傳背景的有限研究也限制了細菌表面展示技術的發(fā)展。

3.2.2 桿狀病毒表面展示系統(tǒng) 以細菌為載體的表面展示系統(tǒng)采用的是原核表達系統(tǒng)，此系統(tǒng)缺乏真核生物蛋白折疊的相關因子和酶類，因此難以完成真核生物蛋白的磷酸化、糖基化、甲基化、乙?；?、二硫鍵異構化等翻譯后修飾，進而難以遞呈復雜的真核生物蛋白，于是像桿狀病毒表面展示這樣的真核生物表面展示技術顯示出更為廣闊的應用前景[51]。

桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體，將外源抗原基因插入到病毒衣殼蛋白基因或者囊膜蛋白基因，外源蛋白與衣殼蛋白或囊膜蛋白融合表達后經過加工處理，在病毒顆粒表面或感染細胞表面進行展示。在該系統(tǒng)中，桿狀病毒表面膜蛋白gp64起著非常重要的作用，外源蛋白融合在gp64蛋白的N端或膜錨定域中，并在gp64蛋白N端的信號肽作用下轉運至質膜引起相應的免疫反應[52]。

作為一種真核生物表面展示系統(tǒng)，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)的構建真正滿足了復雜蛋白質的折疊和修飾需求，增加了外源抗原表達的蛋白種類，成為一種新型的用于疫苗載體設計的真核分子生物學工具。目前，在桿狀病毒表面展示系統(tǒng)中應用最廣泛的病毒載體是苜蓿尺蠖核型多角體病毒和家蠶核型多角體病毒。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)應用于活載體疫苗的構建已成功表達了雞傳染性支氣管炎病毒、甲型流感病毒H5N1亞型、豬瘟病毒、口蹄疫病毒等的保護性抗原[53-56]。

針對不同的外源抗原及宿主細胞特性，尋找其合適的載體與最佳的抗原呈遞策略，可能會是今后活載體疫苗發(fā)展的主要設計程序之一。如天然的腺病毒突變株Onyx-015可以選擇性地在p53基因突變的腫瘤細胞中增殖，而在正常細胞中無法增殖，將這種突變株載體應用于腫瘤治療研究中取得了較好的臨床效果[57]。像這種條件增殖型的載體給疫苗載體設計提供了新思路、新方法。隨著基因工程技術與分子生物學理論的發(fā)展，將會有更多的微生物載體及新型的抗原呈遞策略應用到活載體疫苗的研發(fā)之中。

4 展 望

作為當今基因工程疫苗的熱點領域，活載體疫苗生產成本低，能夠更加安全穩(wěn)定地呈遞外源抗原，誘導免疫宿主產生多種免疫應答。而且，某些微生物載體本身具有佐劑效果，能夠增強疫苗的免疫效應，還可以發(fā)展多價疫苗，起到一針防多病的效果，與傳統(tǒng)疫苗相比有著無可比擬的優(yōu)勢，在防治動物疫病與人類傳染病等復雜疾病方面有著巨大的潛力和廣闊的應用前景。盡管很多新型的活載體疫苗已經取得了較好的臨床效果，但在將其用作生物制品實現(xiàn)大規(guī)模生產方面還存在一些缺陷，如減毒微生物載體對宿主潛在的安全性，活載體受母源抗體的干擾，中和抗體影響免疫效果等。所以，活載體疫苗要應用于實踐還要經過更為嚴格的審批和風險評估。針對減毒微生物載體對宿主潛在的安全性問題，利用不斷發(fā)展的基因工程技術，在保留其侵襲力的基礎上發(fā)展更為安全的減毒方法，提升微生物作為疫苗載體的安全性，是疫苗載體安全性研究的一個重要方向。針對不同的外源抗原，選擇合適的微生物載體，發(fā)展新型的抗原呈遞策略，對活載體疫苗的設計非常重要。因此完善對微生物載體的基因組及遺傳背景研究，深入抗原呈遞機制的研究，能夠進一步推進活載體疫苗的發(fā)展。而且某些微生物載體攜帶外源抗原重組蛋白的分泌量不足，難以獲得較好的免疫效果，因此研究如何增加外源重組蛋白的分泌量，對活載體疫苗的免疫效果至關重要。另外，為了應對微生物載體對宿主動物造成的炎癥等負面效應，一些疫苗的改造修飾技術研究也對活載體疫苗的發(fā)展起著舉足輕重的作用[58]。

隨著生物技術的進步與發(fā)展，活載體疫苗因其所具有的特殊優(yōu)勢將得到更加深入的研究和廣泛的應用?；钶d體疫苗的研究將在動物疫病與人類復雜疾病的防治方面發(fā)揮巨大的作用，為生物學與醫(yī)學的發(fā)展、人類和動物的健康乃至社會的進步做出更加突出的貢獻。