Micro RNA 對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞骨分化作用的研究進(jìn)展

卓麗丹,馮頂麗,蘆 笛,李 紅,傅 營(yíng) 綜述 郭紅延 審校

因手術(shù)、創(chuàng)傷、牙周疾病導(dǎo)致骨缺損和骨缺失的修復(fù)問(wèn)題一直備受人們關(guān)注。臨床骨修復(fù)及再生傳統(tǒng)方法主要有，自體骨移植、異體骨移植、引導(dǎo)組織再生和牽張成骨術(shù)。這些方法存在操作復(fù)雜、損傷大、修復(fù)時(shí)間長(zhǎng)等局限性，近年來(lái)，骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)為骨修復(fù)或者骨再生提供了新的治療策略。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細(xì)胞。MSC具有成骨分化潛能，提取技術(shù)簡(jiǎn)便、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，常用于工程化骨組織的構(gòu)建。目前促進(jìn)干細(xì)胞骨分化的方法有: 肽類(lèi)、表型遺傳、小分子化合物、Micro RNA和物理誘導(dǎo)等。越來(lái)越多的證據(jù)表明MicroRNA參與干細(xì)胞骨分化過(guò)程轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控，本文主要以Micro RNA對(duì)MSC骨分化的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 MSC發(fā)現(xiàn)及作用

1966年，F(xiàn)riedenstein等[1]首先發(fā)現(xiàn)骨髓中存在具有分化為成骨細(xì)胞的干細(xì)胞;至1991年Caplan[2]進(jìn)一步將這類(lèi)干細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為“間充質(zhì)干細(xì)胞”；1999年，Pittenger等[3]在science上發(fā)表，MSC具有多向分化的潛能，激起眾多研究者對(duì)于MSC多向分化潛能的研究[4]。因MSC具有成骨分化潛能，來(lái)源廣，易提取，目前已成為骨組織工程中理想的種子細(xì)胞[5]。

干細(xì)胞骨分化涉及多個(gè)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子、化學(xué)小分子等之間的相互復(fù)雜而又穩(wěn)定的作用。研究者對(duì)MSC成骨分化進(jìn)行大量的研究[6]，BMP、TGF、wnt/β-catenin、Notch、RUNX2、osterix、骨形成蛋白、地塞米松(dexamethasone)、β-甘油磷酸酯等對(duì)MSC骨向分化有重要的作用。近年來(lái)一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出Micro RNA (miRNA)在調(diào)節(jié)骨分化過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。

2 Micro RNA 的概述

miRNA是一種潛在的調(diào)節(jié)成骨分化的內(nèi)源性小RNA分子，一般長(zhǎng)度為21～25 bp，主要作用于mRNA的3’端非編碼序列區(qū)，促進(jìn)或者阻遏翻譯作用。與骨方向分化的調(diào)控方式和通路有密切關(guān)系。單一miRNA可能作用于不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路或者轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)信號(hào)傳導(dǎo)通路或者轉(zhuǎn)錄因子也可由不同的miRNA協(xié)調(diào)控制。因效率高，價(jià)格低，對(duì)于人體無(wú)損害，故成為目前干細(xì)胞骨分化研究熱點(diǎn)，不同的miRNA對(duì)于MSC骨向分化扮演者不同的角色，本文對(duì)miRNA在MSC成骨分化中的作用進(jìn)行如下進(jìn)行闡述。

2.1 miRNA促進(jìn)MSC骨向分化的機(jī)制 不同的miRNA作用靶點(diǎn)不同，其作用機(jī)制也各有差異。下面詳細(xì)介紹一些miRNA促進(jìn)MSC成骨分化的作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路。

2.1.1 BMP信號(hào)傳導(dǎo)通路 骨形成蛋白家族(BMP)對(duì)于干細(xì)胞骨向分化具有促進(jìn)作用，是經(jīng)典傳導(dǎo)通路之一。BMP2、BMP4、BMP7可通過(guò)細(xì)胞膜上的跨膜受體,磷酸化smad1/5/7與smad4形成共價(jià)物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)干細(xì)胞骨向分化[7]。2009年Kim等[8]在實(shí)驗(yàn)中使用慢病毒轉(zhuǎn)載miR-196a在ADSC中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)降低了ADSC的增殖，但對(duì)于ADSC骨向分化具有促進(jìn)作用，對(duì)脂向分化無(wú)任何影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-196a通過(guò)靶向作用于HOXC8 3’UTR抑制HOXC8的蛋白和轉(zhuǎn)錄水平。HOXC8降低堿性磷酸酶(ALP)活性，對(duì)于骨分化具有抑制作用。2014年廖雅馨等[9]利用桿狀病毒介導(dǎo)BMP2+miR-148b的共表達(dá)植入小鼠頭蓋骨4 mm缺損，發(fā)現(xiàn)BMP2+miR-148 b具有協(xié)同作用，促進(jìn)骨缺損愈合，修復(fù)骨面積、骨量、骨密度分別為 (94.7±0.8)%，(89.4 ±11.1)%和(95.7±3.9)%。

2.1.2 TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路 TGF超家族廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化和胚胎的發(fā)育。主要分為T(mén)GF-β1、TGF-β2、TGF-β3其中BMP信號(hào)通路屬于TGF-β1家族。2012年研究發(fā)現(xiàn)，hADMSC中過(guò)表達(dá)miR-22、過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照、以及不作處理對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)miR-22促進(jìn)骨分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-22作用于TGF-β信號(hào)通路，通過(guò)抑制成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)的抑制劑HDAC6促進(jìn)骨分化[10]。成骨早期階段，MIR-29b通過(guò)靶向調(diào)節(jié)WNT/smad/TGF-β信號(hào)通路抑制劑HDAC4，TGFbeta3，ACVR2A，CTNNBIP1和DUSP2，晚期成骨階段，參與控制分化成骨細(xì)胞中的膠原合成，并且使用PCR定量分析成骨標(biāo)志物，成骨標(biāo)志物的水平隨著miR-29b濃度的增加而增加[11]。

2.1.3 GSK信號(hào)傳導(dǎo)通路 GSK-3是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，GSK信號(hào)通路是將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，從而引起細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。系統(tǒng)主要有GSK-3α和GSK-3β兩種亞型。采用人BMSC過(guò)表達(dá)miR-346，其作用靶點(diǎn)GSK-3β，耗盡GSK-3β促進(jìn)骨分化，而過(guò)表達(dá)GSK-3β發(fā)現(xiàn)miR-346表達(dá)降低并且對(duì)于骨分化具有抑制作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miR-346對(duì)于WNT/βcatenin具有激活作用，促進(jìn)骨分化[12]。2015年，Meng等[13]使用志愿者的MSC作為研究對(duì)象， 分別進(jìn)行陰性對(duì)照、miR-21過(guò)表達(dá)、MiRNA-21基因沉默分組研究發(fā)現(xiàn)。miR-21過(guò)表達(dá)GSK-3β磷酸化，72 h后相對(duì)于陰性對(duì)照組，βcatenin表達(dá)增加，并且RUNX2蛋白表達(dá)量增加3倍。

2.1.4 Notch信號(hào)通路 是一種復(fù)雜的信號(hào)通路，具有雙向作用，在脂肪分化過(guò)程中Notch顯示出通過(guò)抑制WNT/βcatenin抑制骨向分化[13，14]。同時(shí)也有研究表明Notch信號(hào)通路具有促進(jìn)骨分化的作用。Notch信號(hào)通路其受體與配體在骨分化中起重要作用，抑制Notch1活性能抑制BMP9誘導(dǎo)的MSC增殖和成骨分化中；DLL1增加BMP9誘導(dǎo)的MSC增殖和成骨分化，Jagged1能增加BMP9誘導(dǎo)的MSC增殖和體外成骨分化[15]。通過(guò)jag1的處理激活Notch信號(hào)通路，檢測(cè)出miR-34a表達(dá)增加。隨后研究發(fā)現(xiàn)，在根尖乳頭干細(xì)胞(SCAP)中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-34a，導(dǎo)致NOTCH2, N2ICD, and HES1蛋白表達(dá)降低，但RUNX2, 鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子OSX, 骨鈣素(OCN)和骨橋蛋白(OPN)蛋白水平上升，促進(jìn)骨分化,轉(zhuǎn)染2周后，SCAP的礦化導(dǎo)致miR-34a下調(diào)；SCAP 轉(zhuǎn)染表達(dá)anti-miR-34a, NOTCH2, N2ICD, and HES1蛋白表達(dá)升高，然而RUNX2, OSX, OCN, 和OPN蛋白水平水平降低[16]。

2.2 miRNA直接作用于骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子 某些miRNA直接作用于特異性轉(zhuǎn)錄因子，RUNX2又稱(chēng)為核心結(jié)合因子，是骨分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)OCN、ALP和Ⅰ型膠原等成骨基因的表達(dá)，在骨分化的過(guò)程中RUNX2處于核心地位(表1)。

miR-9具有促進(jìn)骨分化的作用，觀察miR-9與RUNX2之間的相互關(guān)系。羅紅等[17]取人的骨髓MSC(hBMSC)在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)觀察miR-9的表達(dá)情況，以及過(guò)表達(dá)miR-9和正常組對(duì)照表明，miR-9促進(jìn)RUNX2的表達(dá)，促進(jìn)骨分化。 miR-22在成骨分化過(guò)程中表達(dá)升高，在成脂分化過(guò)程中降低。MiR-22作用機(jī)制為：miR-22與HDAC6的3’端UTR結(jié)合，阻遏HDAC6的翻譯，對(duì)于RUNX2的抑制作用減弱，促進(jìn)骨分化[10]。

3 miRNA抑制MSC骨向分化的作用

miR NA對(duì)于骨分化也可以發(fā)揮抑制作用，主要是通過(guò)阻礙信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活和抑制轉(zhuǎn)錄因子的翻譯。以下介紹一些Micro RNA作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路。

3.1 BMP信號(hào)傳導(dǎo)通路 骨分化的經(jīng)典信號(hào)通路，作用于信號(hào)通路的靶點(diǎn)不同其作用也有所差異。BMPR2是BMP信號(hào)通路的重要受體，對(duì)于激活BMP通路起重要作用。miR-542-3p作為已知的腫瘤抑制劑，在促進(jìn)骨分化的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)miR-542-3p表達(dá)量降低明顯。發(fā)現(xiàn)miR-542-3p對(duì)于骨分化具有抑制作用，利用熒光素酶測(cè)定其作用的靶點(diǎn)為BMP-7，抑制BMP-7及其控制的BMP-7/PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而抑制骨分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)注射miR-542-3p、anti-miR-542-3p進(jìn)一步驗(yàn)證，得出anti-miR-542-3p促進(jìn)骨分化，增加骨密度和骨強(qiáng)度，進(jìn)一步驗(yàn)證生物力學(xué)指標(biāo)值，如極限力、能量和剛度[24]。

3.2 TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路 作為信號(hào)傳導(dǎo)通路中的大家族，smad是TGF-β受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介物質(zhì)。miR-155轉(zhuǎn)染BMP2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞系MC3T3-E1,利用qRT-PCR，14 d不同時(shí)間測(cè)量miR-155的表達(dá)，miR-155呈現(xiàn)一種降低趨勢(shì)，在第7天降低尤為明顯，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性下調(diào)ALP活性和茜素紅染色降低。并使用熒光素酶測(cè)量證實(shí)miR-155結(jié)合于smad5 mRNA 3’端UTR結(jié)合，阻滯信號(hào)通路的傳導(dǎo)[25]。

3.3 Wnt/βcatenin信號(hào)傳導(dǎo)通路 LRP受體在Wnt/βcatenin起重要的作用。在成骨成脂誘導(dǎo)分化過(guò)程中，miR-30大家族具有明顯的促進(jìn)脂肪分化，抑制成骨方向分化的作用。前成骨細(xì)胞MC3T3-E1過(guò)表達(dá)miR-30e 72 h后，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并顯著降低RUNX2、ALP、osterix，而在miR-30e抑制劑轉(zhuǎn)染的前成骨細(xì)胞MC3T3-E1中出現(xiàn)相反的結(jié)果。通過(guò)熒光素酶測(cè)定其靶點(diǎn)為L(zhǎng)RP6下調(diào)β-catenin抑制成骨方向分化[26]。2016年有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a轉(zhuǎn)染人BMSC，明顯抑制RUNX2、ALP、骨鈣素的表達(dá)，ALP染色，茜素紅染色減弱，通過(guò)targetscan粗略分析以及熒光素酶檢測(cè)miR-23a作用靶點(diǎn)LRP5，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)miR-23a蛋白和RNA含量LRP5、β-catenin、Axin2都有所降低，證明miR-23a通過(guò)靶向LRP5抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路抑制成骨[27]。

3.4 直接作用于骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子 RUNX2、OSX作為檢測(cè)骨分化的特異標(biāo)志蛋白,同時(shí)促進(jìn)骨分化。在敲除RUNX2基因的小鼠中，其成骨分化受到完全抑制，軟骨內(nèi)和膜內(nèi)骨化均不能發(fā)生，Osterix 缺失的小鼠無(wú)骨形成，但是具有軟骨內(nèi)骨結(jié)構(gòu)。說(shuō)明RUNX2、OSX在骨分化起著關(guān)鍵作用。

在主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-204過(guò)表達(dá)導(dǎo)致BMP-2誘導(dǎo)骨分化過(guò)程中RUNX2、ALP活性、OCN表達(dá)均有所降低，在成骨誘導(dǎo)細(xì)胞中qRT-PCR檢測(cè)miR-204的表達(dá)量約為正常對(duì)照組的15%，miR-204對(duì)于骨分化具有抑制作用。利用熒光素酶進(jìn)一步檢測(cè)其作用靶點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果顯示miR-204靶向結(jié)合RUNX2，抑制miR-204表達(dá)則出現(xiàn)相反的結(jié)果[28](表2)。

表2 具有抑制作用的miRNA

文獻(xiàn)[29]利用miR-637、anti- miR-637、NC對(duì)照組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到人MSC中，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率以及檢測(cè)細(xì)胞周期分布，miR-637在人MSC中細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為23%，anti- miR-637生長(zhǎng)促進(jìn)率為17%，NC對(duì)照組沒(méi)有明顯差異性，miR-637抑制hMSC生長(zhǎng)并且誘導(dǎo)S期生長(zhǎng)停滯。進(jìn)而使用慢病毒載體穩(wěn)定恢復(fù)和沉默hMSCs中miR-637的表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-637轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，ALP活性顯示降低32%，鈣結(jié)節(jié)被抑制，而在沉默miR-637轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，ALP活性增加22%，并且增強(qiáng)鈣結(jié)節(jié)的形成，促進(jìn)BMP2、RUNX2蛋白的表達(dá)。Targetscan、miRanda、Findtar推定以及熒光素酶驗(yàn)證，miR-637靶向結(jié)合OSX。

綜上所述，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在干細(xì)胞分化過(guò)程中起著穩(wěn)定而復(fù)雜的作用。microRNA主要通過(guò)為作用于成骨相關(guān)的信號(hào)通路分子和直接作用于骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子從而對(duì)MSC成骨分化發(fā)揮促進(jìn)/抑制作用。miRNA的高效，低損傷，低成本等優(yōu)點(diǎn)為臨床治療方法提供了一個(gè)全新的方向。但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的差別和一些miRNA的作用機(jī)制尚不完全清楚。仍需大量的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出高效、不良反應(yīng)少的miRNA，并希望早日用于臨床骨修復(fù)的治療。

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