手足口病病原體EV71的檢測方法學(xué)比較

付 輝，安麗娜，彭碧波

近30年來，全球新發(fā)傳染性疾病達(dá)40余種，中國目前發(fā)現(xiàn)20多種[1]。傳染病的暴發(fā)對人類的生命健康會造成嚴(yán)重威脅，已成為災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其中，腸道病毒71型(enterovirus type 71，EV71)是人類腸道病毒之一，可通過糞口途徑或直接接觸感染者的呼吸道飛沫在人群中傳播[2]。EV71感染的臨床表現(xiàn)通常為手足口病(hand-foot and mouth disease，HFMD)，多感染5歲以下的兒童，受影響兒童經(jīng)常出現(xiàn)3～4 d發(fā)燒和手、腳、肘、膝和頰黏膜等部位的皰疹[3]。在大多數(shù)情況下，這種疾病是溫和、自限的。然而，EV71感染有時會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如無菌性腦膜炎、腦炎、小兒麻痹癥樣癱瘓，甚至死亡。即便存活下來的患兒也會有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[4]。因此，對于HFMD病原體EV71的快速準(zhǔn)確檢測對于臨床診斷治療尤為重要。本研究通過比較四種不同的方法對EV71感染的檢測，期望為臨床檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culture collection，ATCC)，完全培養(yǎng)液為10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，1%雙抗(pen-strep)的MEM培養(yǎng)液，所有細(xì)胞均在含5% CO2的37 ℃ 孵箱中培養(yǎng)并傳代。病毒株EV71(H)株購自ATCC，于Vero細(xì)胞中傳代。

1.2 試劑耗材和儀器 一步法熒光定量試劑盒購自Invitrogen公司，總RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自QIAGEN公司，MEM液體培養(yǎng)液、青鏈霉素、胰酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和FBS購自Invitrogen公司，蛋白提取試劑和蛋白酶抑制劑購自Thermo公司，β-actin單抗和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗鼠二抗購自cell signaling公司，羊抗鼠綠色熒光二抗和免疫染色固定液購自碧云天生物技術(shù)研究所，EV71抗體購自Abnova公司。二氧化碳孵箱購自Thermo公司，倒置顯微鏡和熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司，Bio-Rad濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RAD公司，ABI 7500 Fast 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)儀，購自ABI公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)法測定50%組織細(xì)胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50) 將3×104個/孔的Vero細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，待到細(xì)胞增長至75%的孔面積時，吸棄舊的培養(yǎng)液。將病毒原液按照10倍梯度依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。用不同稀釋度的病毒液100 μl/孔感染細(xì)胞1 h。1 h后吸棄病毒液，加入維持液100 μl/孔，將細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察不同病毒濃度72 h的CPE，對觀察結(jié)果進(jìn)行記錄。

將病毒感染細(xì)胞與正常細(xì)胞作對比，以細(xì)胞狀態(tài)改變或死亡比例分別標(biāo)記為4(細(xì)胞死亡比例76%～100%)、3(細(xì)胞死亡比例51%～75%)、2(細(xì)胞死亡比例26%～50%)、1(細(xì)胞死亡比例0～25%)、0(細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化或全部存活)，采用Reed & Muench方計算TCID50。

1.3.2 Real-Time PCR檢測 將9×105個/孔的Vero細(xì)胞接種于6孔板中，溫度37 ℃、 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用RNeasy Mini Kit提取細(xì)胞總RNA，使用一步法熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測，特異引物序列見表1。25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件50 ℃ 3 min，95 ℃ 10 min，40個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s)。采用Sybr-GreenER熒光檢測系統(tǒng)對目的基因進(jìn)行相對定量分析， 采用看家基因β-actin作為內(nèi)參照對Ct值進(jìn)行歸一化處理，基因表達(dá)差異計算方法采用ΔΔCt法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批，每批次3個復(fù)孔。

表1 特異引物序列

1.3.3 Western blot檢測 將9×105個/孔的Vero細(xì)胞接種于6孔板中，37 ℃、 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用蛋白提取試劑提取細(xì)胞總蛋白后進(jìn)行檢測。20 μg總蛋白上樣電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入EV71一抗(1∶1000)和β-actin一抗(1∶1000)，室溫孵育2 h后經(jīng)TBST洗脫，再孵育HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h后經(jīng)TBST洗脫顯影。

1.3.4 免疫熒光法檢測 將9×105個/孔的Vero細(xì)胞接種于6孔板中，37 ℃、 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃ PBS洗3次。加入300 μl/孔固定液，固定10 min。4 ℃ PBS漂洗2次。加入0.5% Triton 穿孔15 min。4 ℃ PBS漂洗3次。1% BSA封閉1 h。TBST洗3次，加入含1% BSA的TBST稀釋的EV71抗體(1∶500)，于37 ℃雜交2 h。TBST漂洗3次，加入TBST稀釋的羊抗鼠熒光二抗(1∶500)，于37 ℃雜交1 h。TBST漂洗3次，觀察照像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同感染量的病毒RNA改變水平的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TCID50測定結(jié)果 首先利用CPE法檢測EV71病毒毒力，病毒感染72 h后觀察記錄細(xì)胞病變見表2，經(jīng)計算其TCID50為10-4。

2.2 Western blot檢測結(jié)果 如圖1所示，利用Western blot檢測EV71蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EV71感染24 h后即可檢測到明顯的病毒蛋白表達(dá)，并且病毒感染量越高， 檢測到的條帶越清晰。 而10-5感染量的病毒24 h無法檢測病毒蛋白的條帶。

表2 不同稀釋濃度手足口病病原體EV71病毒液感染校后72 h的CPE

注：CPE, 細(xì)胞病變效應(yīng)；10-6、10-7和10-8組CPE觀察結(jié)果均記作0

圖1 手足口病病原體EV71感染24 h后各病毒量病毒蛋白的表達(dá)

2.3 免疫熒光法檢測結(jié)果 如圖2所示，利用免疫熒光法檢測EV71蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EV71感染24 h后即可檢測到明顯的病毒蛋白表達(dá)，并且病毒感染量越高，檢測到的熒光越多。而10-5感染量的病毒24 h只能檢測到較少熒光。

圖2 手足口病病原體EV71感染24 h后各病毒量病毒蛋白的表達(dá)

2.4 Real-Time PCR檢測結(jié)果 如圖3所示，采用Real-Time PCR檢測，可以靈敏地檢測到病毒RNA，即使其他方法檢測不到的10-5感染量，Real-Time PCR法也可以檢測到。

圖3 手足口病病原體EV71不同感染量病毒的RNA的水平

3 討 論

EV71于1969年首次從美國加州患者身上分離得到，隨后在全球范圍內(nèi)多次暴發(fā)[5-9]。EV71感染引起的HFMD主要臨床癥狀為手、足和口腔黏膜的皰疹病變，少數(shù)重癥感染者還可引起腦炎、無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓炎等神經(jīng)系統(tǒng)組織的病變，甚至死亡[10,11]。自2008 年以來，中國HFMD發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈逐年上升趨勢，將會嚴(yán)重影響社會的穩(wěn)定與發(fā)展[12]。對于EV71的早期、快速、準(zhǔn)確診斷對于臨床治療十分重要，在病毒感染尚未對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害之前進(jìn)行治療，防止神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生對于兒童的成長發(fā)育至關(guān)重要。本研究通過對不同方法學(xué)的比較來研究適合不同情況EV71感染的診斷，旨在為臨床有效快速檢測和治療提供依據(jù)。

目前對于EV71的檢測有各種不同的方法，均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，以便于EV71感染不同階段的檢測。本研究利用4種不同實(shí)驗(yàn)方法對EV71的感染進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)4種方法都可檢測到EV71的感染，只是不同的方法對病毒感染量的敏感性不同，整個實(shí)驗(yàn)周期也不同，對實(shí)驗(yàn)人員的操作要求也不同。其中，CPE法是最容易、簡便的方法，但是實(shí)驗(yàn)周期太長且靈敏度低。Western blot方法對于病毒感染量有一定要求，較低的感染量無法檢測病毒，但是相對于CPE方法全程至少96 h，Western blot法所需時間減少。免疫熒光法和Western blot法所需時間和檢測到的結(jié)果基本一致，對于病毒感染量同樣有一定要求，較低的感染量無法檢測病毒。Real-Time PCR是4種方法中最靈敏，同時也是最快速的方法，48 h即可完成檢測。因此，對于臨床就診的患者可以根據(jù)已經(jīng)發(fā)病的程度選擇一種或幾種合適的方法對病原體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的確定，為臨床用藥治療提供依據(jù)。

除了本研究所利用的實(shí)驗(yàn)方法，目前還有基因微陣列檢測[13]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked imnnosoboynt assay,ELISA)兩種檢測方法，可用于EV71感染的測定，這兩種方法同樣有著各自優(yōu)缺點(diǎn)。目前臨床上應(yīng)用較多的還是Real-Time PCR和ELISA這兩種方法，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷創(chuàng)新，相信在不久的將來會有更多更加完善的適合臨床檢測的方法被應(yīng)用到實(shí)踐中，為一線醫(yī)護(hù)工作者提供更好的診斷支撐，為HFMD的預(yù)防和治療提供更好的保障。

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