磁珠富集法開發(fā)蕨麻SSR標(biāo)記引物

富貴，李軍喬，包錦淵，白世俊，韋梅琴(1.青海民族大學(xué)青藏高原蕨麻研究中心，青海 西寧810007；2.“青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用”國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，青海 西寧810016；3.青海省生物技術(shù)與分析測試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810007；.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧810016)

蕨麻(Potentillaanserina)屬薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla)，青藏高原地區(qū)稱之為人參果、 延壽果或蓬萊果等[1-2]，是一種典型的多年生草本植物，主要通過匍匐莖克隆繁殖。蕨麻分布地域遼闊，除我國北部如青海、西藏、新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等地有分布以外；歐洲、南美洲西南部的智利及亞洲其他地區(qū)；北半球溫帶地區(qū)；位于大洋州的新西蘭和塔斯馬尼亞島等地都有蕨麻分布[3]。

蕨麻根結(jié)構(gòu)形態(tài)在不同溫度或海拔地區(qū)表現(xiàn)出形態(tài)特征差異性，生長在海拔較高、溫度較低的高原地區(qū)，其根會(huì)膨大形成棒狀、球狀、線結(jié)狀等形態(tài)。這種膨大根富含淀粉、膳食纖維、蛋白質(zhì)和多糖等營養(yǎng)成分，更富含人體所需要的各種維生素和微量元素，具有很好的營養(yǎng)和保健作用[4-5]，可當(dāng)做食物直接食用，也可入藥和用于保健品的加工，在當(dāng)?shù)乇划?dāng)做一種民俗食品而廣泛推崇；近幾年來國家對(duì)青藏高原地區(qū)生態(tài)環(huán)境保護(hù)特別重視，野生蕨麻棲息地廣泛，其生態(tài)適應(yīng)性廣，尤其是河灘邊，草甸等水分充足雨量較大的地區(qū)；蕨麻具有抗寒性強(qiáng)，耐干旱，喜陰濕，耐澇等生理特征；加之其莖呈蓮座狀，根系發(fā)達(dá)，長 7～18 cm，可防止水土流失，防風(fēng)固沙，為保護(hù)青藏高原草原生態(tài)環(huán)境及生態(tài)恢復(fù)提供了有力的資源保障[3]。蕨麻屬于野生資源，以前人們獲取蕨麻鮮果的唯一方式是人工野外采挖，這不僅導(dǎo)致青藏高原地區(qū)草地嚴(yán)重破壞，而且造成了蕨麻野生資源的嚴(yán)重流失。所以大量培育并開發(fā)蕨麻栽培種顯得尤為迫切，自青海民族大學(xué)青藏高原蕨麻研究中心通過引種、馴化、人工選育出了一系列蕨麻栽培種如蕨麻1號(hào)，蕨麻2號(hào)等品種以來，人工野外采挖規(guī)模極大縮減，不僅使野生蕨麻資源得到保護(hù)，而且推動(dòng)了蕨麻的種植、產(chǎn)品加工的產(chǎn)業(yè)化。鑒于蕨麻具有很大的食用和藥用開發(fā)價(jià)值，以及在青藏高原生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)中的重要性，蕨麻相關(guān)育種、栽培工作還需進(jìn)一步加強(qiáng)和推進(jìn)。

目前對(duì)于蕨麻遺傳學(xué)方面的研究甚少，課題組對(duì)于蕨麻細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻具有四、五、六倍體3種倍性，其中主要以四倍體為主，蕨麻倍性復(fù)雜，對(duì)于不同倍性基因組之間的關(guān)系也不清楚[6]，這為蕨麻育種工作帶來了極大的困難。分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳研究中，雖然課題組已開發(fā)出了蕨麻AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)分子標(biāo)記，并建立了PCR擴(kuò)增體系，初步從分子水平探明了青藏高原蕨麻種質(zhì)資源概況及分布，但是關(guān)于蕨麻SSR(Simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列)分子標(biāo)記的研究還未曾報(bào)道。簡單重復(fù)序列廣泛分布在物種全基因組內(nèi)、具共顯性遺傳特點(diǎn)、另外其具有擴(kuò)增穩(wěn)定、操作簡單、結(jié)果多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛用于動(dòng)植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、分子遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、指紋圖譜構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助育種等研究中[7]。目前SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用分析已在許多植物上開展，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum) 、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、油菜(Brassicanapus)等[8-12]。磁珠富集法是一種原始，但簡單、有效的植物SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法，其主要原理是，植物基因組酶切、后經(jīng)PCR擴(kuò)增，與含有生物素標(biāo)記的特異性SSR序列探針雜交，然后用包被著鏈親和素的磁珠，對(duì)含有生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行磁力吸附，從而獲得含有目標(biāo)片段的重復(fù)序列[13]。本研究旨在利用磁珠富集法開發(fā)出對(duì)分析蕨麻有用的SSR引物，并分析其特點(diǎn)和通用性，以期豐富蕨麻分子標(biāo)記技術(shù)類型，促進(jìn)蕨麻基因組學(xué)研究，加快蕨麻育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究共選取12個(gè)具有明顯地理分布差異的蕨麻樣本用于SSR引物初步篩選驗(yàn)證，其中青海蕨麻2號(hào)用于開發(fā)蕨麻SSR引物，所有蕨麻參試材料均采自青?；ブ祥T峽蕨麻種質(zhì)資源圃，材料相關(guān)信息詳見表1。每個(gè)材料分別取生長良好的同一植株新鮮嫩葉2～3片，裝入已放有干燥硅膠的自封袋內(nèi)，編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室，待葉片完全干燥后放入-20 ℃冰箱保存。采樣時(shí)間為2015年7月，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2016年1-3月。

表1 供試材料及原產(chǎn)地詳細(xì)信息Table 1 Materials and detailed information of origins

1.2 DNA的提取

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)DN15)進(jìn)行DNA提取，得到樣品DNA溶液。

1.3 SSR序列富集

1.3.1基因組雙酶切與接頭連接 基因組用EcoRⅠ，Mse I 進(jìn)行雙酶切，酶切時(shí)間為3 h，酶切體系為50 μL，酶切體系包含DNA 1 μg、10×T4DNA ligase 5 μL、Buffer 5 μL、EcoRⅠ (10 U·μL-1)和MseI (10 U·μL-1)各1 μL、其余用雙蒸水補(bǔ)齊，酶切完成后，沸水浴加熱5 min失活，室溫冷卻后，利用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。連接體系為20 μL，含酶切產(chǎn)物7 μL，EcoRⅠ接頭和MseI接頭各75 pmol，接頭序列分別為：5′CCTCGTAGACTGCGTACC 3′，5′TTAACCATGCGTCAG 3′；5′GACGATGAGTCCTGGC 3′，5′GGCGGTC CTGAGTA 3′、T4DNA ligase 1.5 U、10×T4DNA ligase Buffer 2 μL，其余用雙蒸水補(bǔ)齊，4 ℃連接過夜。

1.3.2預(yù)擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系共為20 μL，包含連接接頭的模板DNA 2 μL、2×PCRmix 10 μL、E00(5′ GACTGCGTACCAATTC 3′)10 pmol、M00(5′GATGAGTCCTGAGCGG 3′)10 pmol、Taq酶0.2 U，其他用雙蒸水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性45 s；退火溫度為50 ℃，時(shí)間為45 s；在72 ℃下延伸45 s、30次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min后4 ℃冷藏保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測分析。

1.3.3磁珠富集含有SSR位點(diǎn)的片段 1)平衡磁珠及雜交:參照MagneSphere Magnetic Separation Products(Promega)試劑盒操作說明書，拿出冷藏保存在4 ℃冰箱中的磁珠，輕輕混勻，以便使磁珠充分散開。利用磁架收集，靜置約1 min，使所有磁珠吸附在管壁一側(cè)。用微量移液器吸去管內(nèi)液體。加入300 μL 0.5×SSC(saline sodium citrate，檸檬酸鈉緩沖液)將磁珠清洗3次，清洗過程中每次都用磁架收集，緩緩移去清洗液后加入100 μL 0.5×SSC溶液使磁珠懸浮。將200 pmol用生物素標(biāo)記的(AG)15、(GT)15探針加入100 μL PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在沸水浴中高溫變性5 min后，快速放置在冰上10 min后，加入2.5 μL 體積的20×SSC溶液，溫度為62 ℃水浴鍋中溫浴30 min，取出后室溫自然冷卻。待冷卻后的雜交混合液和已平衡好的磁珠混合均勻，室溫下靜置10 min，每隔2～3 min輕輕晃動(dòng)一次，確保生物素能夠完全吸附在包被有親和素的磁珠上。

2)漂洗與洗脫:在室溫下，利用磁架吸附磁珠，移液槍移走上清溶液，用0.1×SSC緩沖液清洗4次磁珠，每次SSC緩沖液用量為300 μL，最后一次清洗，用體積為300 μL 的0.08×SSC。加入100 μL滅過菌的ddH2O，緩慢搖動(dòng)離心管以便使磁珠能夠全部懸浮，在90 ℃溫度下靜置10 min，期間緩緩晃動(dòng)2～3次，利用磁架吸附磁珠，然后收集上清溶液移入另一滅過菌的1.5 mL離心管內(nèi)。在上清液內(nèi)加入100 μL滅過菌的ddH2O，重復(fù)上述步驟。最后，收集的上清液加入200 μL滅過菌的ddH2O，在90℃下靜置20 min，期間緩緩晃動(dòng)3～5次，再次用磁架吸附磁珠，然后上清液被收集在另一個(gè)滅菌的1.5 mL離心管內(nèi)，其收集液用于做對(duì)照試驗(yàn)。

3)PCR擴(kuò)增:利用冷凍干燥機(jī)分別使兩管體積為200 μL的回收產(chǎn)物濃縮至體積為20 μL，然后以其為模板再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如表2所示。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下，變性時(shí)間為45 s，退火溫度為50 ℃，時(shí)間為45 s，在72 ℃溫度下延伸45 s，進(jìn)行5次循環(huán)；最后，72 ℃下延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃下保存即可。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測，電泳條帶為彌散狀才可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.4重組轉(zhuǎn)化與克隆鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后冷凍干燥濃縮至體積約6 μL，濃縮后產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入到感受態(tài)細(xì)胞E.coil中。涂布于含氨卞青霉素的LB培養(yǎng)皿上，倒置，于37 ℃下培養(yǎng)過夜。利用pMD18-T載體的通用擴(kuò)增引物M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)或RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)各自與重復(fù)序列(AG)9所組成的雙引物對(duì)AG富集文庫菌落進(jìn)行擴(kuò)增篩選檢測。取5 μL PCR產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，對(duì)于能擴(kuò)增出清晰電泳條帶的菌落再進(jìn)行質(zhì)粒測序。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of PCR amplification

1.3.5序列分析及SSR引物篩選 利用Chromas軟件打開測序結(jié)果，對(duì)測序峰圖進(jìn)行檢查，測序結(jié)果經(jīng)手工校正，并挑選出包含有SSR位點(diǎn)的序列。利用DNAman軟件刪除載體和接頭的序列，再用CodonCode Aligner軟件對(duì)包含有SSR位點(diǎn)的序列進(jìn)行比對(duì)分析，刪除重復(fù)的序列后用引物設(shè)計(jì)軟件Primers 5設(shè)計(jì)SSR引物。采用以下PCR的反應(yīng)體系對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測，PCR的反應(yīng)體系20 μL,包括模板DNA 25 ng、10×Buffer 2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、10 μmol·L-1F-primer 0.25 μL、10 μmol·L-1R-primer 0.25 μL、5 U·μL-1Taq酶0.2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。SSR PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃(退火溫度在54 ℃上下波動(dòng))復(fù)性，時(shí)間為35 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)初篩設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行復(fù)篩，檢測樣本數(shù)量為12，篩選多態(tài)性豐富、且條帶清晰、可穩(wěn)定擴(kuò)增的引物，統(tǒng)計(jì)電泳檢測結(jié)果，計(jì)算SSR引物相關(guān)參數(shù)，12個(gè)樣本等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’ s 基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)都是在 Popgene32 1.32軟件中完成；使用PIC Calc 0.6軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕨麻基因組酶切及SSR位點(diǎn)富集

取片段大小合適的蕨麻DNA 目標(biāo)片段為模板進(jìn)行微衛(wèi)星探針雜交，并通過 PCR 預(yù)擴(kuò)增，有效放大基因組酶切片段，從而得到豐富的用于測序的富含簡單重復(fù)序列的基因組片段，方法簡便快捷。本研究中蕨麻全基因組經(jīng)過EcoRⅠ 和MseⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物與接頭連接并經(jīng)PCR 預(yù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳圖檢測，檢測結(jié)果顯示電泳條帶成彌散狀，對(duì)PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSR位點(diǎn)富集，獲得短基因組片段大小分布在200～1000 bp之間(圖1)，滿足后續(xù)轉(zhuǎn)化和克隆條件。

圖1 磁珠富集獲得的SSR短基因組 PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of short genome by magnetic beads enrichment product 泳道1、2為富集產(chǎn)物 PCR 擴(kuò)增電泳條帶。1, 2: PCR electrophoresis results of enrichment products. M: 標(biāo)記Marker.

2.2 目的片段陽性克隆篩選、測序及引物設(shè)計(jì)

以菌液為模板，特異性引物M13進(jìn)行擴(kuò)增。利用 PCR擴(kuò)增法篩選單克隆。如果擴(kuò)增得到電泳條帶顯示2條或2條以上的電泳條帶，則表明克隆成功，共獲得有效克隆236個(gè)(圖2)，從陽性克隆中隨機(jī)選出80個(gè)克隆進(jìn)行測序。對(duì)所測序列結(jié)果通過DNAman軟件進(jìn)行比對(duì)分析，篩選出68條序列(85%)為特有序列，剩余的 12 條序列都是相同重復(fù)序列。通過SSRhunter軟件分析查找68條序列中的簡單重復(fù)序列位點(diǎn)，共掃描檢測出SSR位點(diǎn)162個(gè)，選擇具有SSR位點(diǎn)的序列共40條，參照Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件說明書操作步驟，總共設(shè)計(jì)出40對(duì)引物，引物序列送至上海生工生物工程股份有限公司，最終合成引物共40對(duì)。

圖 2 陽性克隆篩選Fig.2 Screening positive clones M：標(biāo)記Marker (100 bp DNA ladder).泳道 1、 2、 3為有效克隆。 Lane 1，2，3 were effective clone.

2.3 蕨麻微衛(wèi)星特征分析

本實(shí)驗(yàn)最終獲得的蕨麻SSR引物序列40對(duì)，編號(hào)依次為P1～P40(表3)，對(duì)40對(duì)引物序列分析發(fā)現(xiàn)，以CT和AG為重復(fù)單位的引物占最多，其中以CT為重復(fù)單位的引物14對(duì)(35%)，重復(fù)次數(shù)介于10～20之間7對(duì)，20對(duì)以上的3對(duì)，最大重復(fù)次數(shù) 32次；AG為重復(fù)單位的引物15對(duì)(37.5%)，重復(fù)次數(shù)介于10～20之間7對(duì)，20對(duì)以上的2對(duì)，最大重復(fù)次數(shù)23次。參考Weber對(duì)微衛(wèi)星分類[14]，將所獲得的微衛(wèi)星序列分為3類，其中完全型微衛(wèi)星34對(duì)(85%)，非完全型類型3對(duì)(7.5%)，復(fù)合型類型3對(duì)(7.5%)。沒有觀察到3堿基為單位的重復(fù)序列。

2.4 蕨麻SSR引物初步篩選及多態(tài)性分析

選取了12個(gè)地理分布差異較明顯的蕨麻材料，提取基因組DNA，利用聚丙烯氨酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，對(duì)40對(duì)引物進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果顯示未擴(kuò)增出條帶的引物3對(duì)，17對(duì)引物條帶不清晰或沒有多態(tài)性，20對(duì)引物(P3、P5、P6、P7、P8、P12、P15、P18、P19、P21、P24、P25、P26、P27、P28、P30、P32、P31、P34、P40)可以擴(kuò)增出清晰，穩(wěn)定，且多態(tài)性豐富的電泳條帶，擴(kuò)增效率達(dá)50%，20對(duì)引物已上傳至GenBank,登錄號(hào)詳見表4。對(duì)篩選出的20對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果做了初步分析，篩選出的引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)總共為338個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出17個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，引物P25所擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)最多，為29個(gè)，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.244個(gè)；多態(tài)性信息含量(PIC)大小為0.8234～0.9570，變化范圍較小，平均為0.8996；Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)平均為0.1768，最高為0.2521，最低為0.1208；Shannon’s 信息指數(shù)(I)最高值為0.4020，最低為0.2332，平均為0.3078，各參數(shù)詳見表4，部分材料微衛(wèi)星引物多態(tài)性分析檢測電泳圖見圖3。利用20對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果對(duì)12份材料的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，12份材料UPGMA聚類分析結(jié)果表明：參試材料之間具有較為復(fù)雜的遺傳關(guān)系(圖 4)。

表3 開發(fā)出的蕨麻40條引物基本信息Table 3 Basic information of 40 developed primers for P. anserina

表 4 20對(duì)SSR 標(biāo)記基于 12 份蕨麻材料的遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters based on 20 SSR markers in 12 P. anserina plants

圖3 P1～P4引物篩選電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of P1-P4 primer screening

圖4 基于SSR標(biāo)記的12份材料聚類分析Fig.4 UPGMA dendrogram of twelve materials based on SSR markers1～12：所選用的蕨麻材料編號(hào)(詳見表1)。1～12: Code of selected Potentilla anserina materials (see details in Table 1).

3 討論

目前獲得SSR分子標(biāo)記引物的途徑主要有以下幾種，一是通過生物信息學(xué)的技術(shù)手段，在現(xiàn)有的大量生物共享數(shù)據(jù)庫中如 NCBI、GeneBank及EST序列數(shù)據(jù)中搜尋與目標(biāo)物種相關(guān)的SSR序列，該方法直接有效，但是已開發(fā)的物種相對(duì)較少，具有局限性[13]。也可利用已開發(fā)的近緣物種SSR序列進(jìn)行擴(kuò)增，需進(jìn)行篩選，選擇重復(fù)性較高，多態(tài)性豐富的引物。但是蕨麻分子生物學(xué)方面的研究較少，除課題組開發(fā)過其AFLP引物外，SSR分子標(biāo)記開發(fā)研究還未有人涉及。傳統(tǒng)雜交富集法，通過建立和篩選微衛(wèi)星富集文庫，提高了克隆效率，是一種有效的經(jīng)典的方法。

本研究通過磁珠富集法最終獲得蕨麻SSR有效序列80條，設(shè)計(jì)出可擴(kuò)增SSR引物40對(duì)，分離效率為50%，比常規(guī)開發(fā)陽性分離率(2%～3%)[15]高出很多，具有多態(tài)性引物篩選出共20對(duì)，多態(tài)性引物占總開發(fā)引物50%。前人研究發(fā)現(xiàn)利用磁珠富集法可以極大地增加獲得SSR陽性克隆的概率，陽性克隆獲得率可以增加至50%～60%[16]。本研究所獲得的陽性克隆率比其他常見植物較高，與上述觀點(diǎn)較一致。如李炟等[17]研究馬尾松(Pinusmassoniana)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為13.8%；鄧欣等[13]建立的用生物素包被的Dynal磁珠富集分離亞麻(Linumusitatissimum)微衛(wèi)星分子標(biāo)記方法，得到的 CT插入文庫中微衛(wèi)星的陽性克隆率>22.99%；薛華柏等[18]在開發(fā)分離小黃李(Prunussalicina)基因組微衛(wèi)星試驗(yàn)中也使用了磁珠富集法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：獲得了31個(gè)陽性克隆，隨機(jī)選擇18個(gè)克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果對(duì)比分析，最后獲得12 條包含SSR位點(diǎn)的特異序列。不同植物實(shí)驗(yàn)材料間陽性克隆率差異可能和基因組結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。雖然利用生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組測序已成為SSR引物標(biāo)記開發(fā)的有效手段，但傳統(tǒng)的雜交富集法為蕨麻SSR標(biāo)記開發(fā)提供了有效的途徑。本研究所獲得的蕨麻SSR引物主要以完全型為主，完全型占到了85%，非完全型和復(fù)合型所占比例較低(15%)，重復(fù)單位以CT和AG為主，這和其他植物研究結(jié)果一致，如王艷紅等[19]利用雜交富集研究菠蘿蜜(Artocarpusheterophyllus)SSR標(biāo)記結(jié)果表明完美型引物占87.5%，重復(fù)單位也主要是CT和AG; 胡磊等[20]用相同方法研究花櫚木(Ormosiahenryi)所獲得的微衛(wèi)星序列中以完美型為主，有 21 個(gè)，占整個(gè)微衛(wèi)星序列的87.5%，非完美型與混合型較少，重復(fù)堿基數(shù)以雙核苷酸居多，其中以(GA)n/(CT)n 最多。Weber[14]研究表明，SSR序列中2堿基重復(fù)序列的重復(fù)頻數(shù)，如果超過12 次，該SSR標(biāo)記具有較高多態(tài)性信息含量 (PIC，polymorphic information content)值的可能性增加。Orit 等[21]也認(rèn)為當(dāng)重復(fù)次數(shù)大于等于16 時(shí)，SSR標(biāo)記PIC值大于0.5時(shí)可以進(jìn)行相應(yīng)的多態(tài)性分析。本研究所獲得的蕨麻微衛(wèi)星序列重復(fù)數(shù)在 12 次以上的有 23 個(gè)，占總數(shù)的67.5%。重復(fù)次數(shù)高的序列占大多數(shù)，提高了獲得多態(tài)性微衛(wèi)星分子標(biāo)記的概率。而且Smulders 等[22]認(rèn)為重復(fù)序列重復(fù)頻數(shù)較高的微衛(wèi)星在分析物種遺傳多樣性時(shí)更有效，因?yàn)橹貜?fù)次數(shù)高時(shí)才可在不同種間產(chǎn)生多態(tài)性，種內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)也能被檢測到，但重復(fù)次數(shù)少的微衛(wèi)星具有局限性，只能在種間檢測出多態(tài)性位點(diǎn)。

本研究首次開發(fā)出了蕨麻SSR微衛(wèi)星引物40條，初步篩選得到20條擴(kuò)增穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物，20對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果揭示出蕨麻參試材料的遺傳多樣性水平較高[23]；PIC指數(shù)也常常被用于揭示遺傳基因的變異程度，Botstein等[24]所提出的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為：若PIC<0.25 時(shí)，多態(tài)性位點(diǎn)較低，PIC介于0.25～0.50 時(shí)，多態(tài)性位點(diǎn)屬于中度豐富，而PIC大于0.50 時(shí)，則說明該位點(diǎn)具有豐富的多態(tài)性。本實(shí)驗(yàn)所得到20對(duì)引物多態(tài)性信息含量為0.8996，揭示出所篩選到的20對(duì)蕨麻引物多態(tài)性豐富，在蕨麻種群內(nèi)通用性較高。本研究中12份材料聚類結(jié)果比較復(fù)雜，聚類結(jié)果并沒有與其資源分布相對(duì)應(yīng)，如材料9和材料10地理分布相差很大，但卻顯示親緣關(guān)系較近，這一結(jié)果可能與蕨麻克隆生殖的特殊繁殖方式有關(guān)；另外，本研究旨在開發(fā)和分析蕨麻SSR引物與其特征，所以每個(gè)地區(qū)隨機(jī)選取參試材料只有一個(gè)，聚類結(jié)果雖然并不能充分解釋不同地區(qū)蕨麻的親緣關(guān)系，但為下一步揭示青藏高原地區(qū)蕨麻遺傳多樣性可行性奠定了基礎(chǔ)。近幾年來，關(guān)于利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行物種遺傳多樣性分析，連鎖圖譜、指紋圖譜構(gòu)建的研究多有報(bào)道。如徐軍等[25]利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了煙草(Nicotianatabacum)核心種質(zhì)中80份普通煙草種質(zhì)的指紋圖譜。張金華等[26]利用磁珠富集法開發(fā)出有效的SSR分子標(biāo)記并分析了蒙古繡線菊(Spiraeamongolica)和高山繡線菊(Spiraeamongolica)群體遺傳結(jié)構(gòu)。姜志艷等[27]利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了四倍體雜交冰草(Agropyroncristatum)的遺傳連鎖圖譜。所以本研究所獲得的20對(duì)蕨麻SSR標(biāo)記可用于后續(xù)篩選多態(tài)性豐富、遺傳信息含量高的分子標(biāo)記、蕨麻種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、青藏高原蕨麻群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和品種指紋圖譜的構(gòu)建等相關(guān)研究中。

4 結(jié)論

本研究選取了青海蕨麻2號(hào)為材料，利用磁珠富集法開發(fā)出蕨麻SSR有效序列80條，設(shè)計(jì)出可擴(kuò)增SSR引物40對(duì)，分離效率為50%，比常規(guī)開發(fā)陽性分離率高出很多；為了驗(yàn)證40對(duì)引物的適用性，選取了主要來自青藏高原范圍內(nèi)12份蕨麻材料，利用聚丙烯氨酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，對(duì)40對(duì)引物進(jìn)行了初步篩選，20對(duì)引物(P3、P5、P6、P7、P8、P12、P15、P18、P19、P21、P24、P25、P26、P27、P28、P30、P32、P31、P34、P40)可以擴(kuò)增出清晰，穩(wěn)定，且多態(tài)性豐富的電泳條帶，擴(kuò)增效率達(dá)50%；20對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果分析顯示，擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)共338個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出17個(gè)；平均有效等位基因數(shù)(Ne，1.244)，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H，0.1768)和Shannon’s 信息指數(shù)(I，0.3078)揭示出蕨麻參試材料的遺傳多樣性水平較高；本實(shí)驗(yàn)開發(fā)出20對(duì)蕨麻SSR引物多態(tài)性信息含量(PIC)為0.8996，說明篩選到的20對(duì)引物具豐富的多態(tài)性，在蕨麻種群內(nèi)通用性較高；12份材料聚類結(jié)果表明來自不同地區(qū)的蕨麻親緣關(guān)系較為復(fù)雜，不能完全與其分布區(qū)域相對(duì)應(yīng)。20對(duì)SSR引物為蕨麻遺傳變異研究提供了新的分子標(biāo)記工具，可用于后續(xù)蕨麻種質(zhì)資源開發(fā)利用、遺傳多樣性分析、青藏高原蕨麻群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和品種指紋圖譜構(gòu)建等相關(guān)研究中。

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