葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在紫花苜蓿干旱耐受性中的響應(yīng)

熊麗麗,閆霜,李萍,楊國柱,尹衛(wèi),嚴(yán)曉霞,張韓(.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧8006；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 8006)

紫花苜蓿(Medicagosativa)，又稱苜蓿，薔薇目、豆科、苜蓿屬多年生的草本植物，也是世界上種植面積最廣、最主要的牧草之一，苜蓿的年產(chǎn)值也很高。如今人們對紫花苜蓿的使用非常廣泛，已經(jīng)從傳統(tǒng)的牧草改良擴展到了很多方面，在生產(chǎn)疫苗、工業(yè)酶制劑和藥用蛋白等很多方面都以紫花苜蓿作為生物反應(yīng)器，紫花苜蓿在人類安全、畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)以及健康方面的應(yīng)用具有很廣泛的應(yīng)用前景[1]。紫花苜蓿的抗逆性特別強，有抗旱耐寒、耐鹽堿、適應(yīng)性廣和再生性強等優(yōu)良的特點。優(yōu)良的苜蓿草料為畜牧業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)，畜牧業(yè)的成長既能穩(wěn)固農(nóng)業(yè)的成長又能增進農(nóng)業(yè)的成長。因此苜蓿的生產(chǎn)，將成為連接畜牧業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的橋梁。

為了保護生態(tài)環(huán)境，改變中西部地區(qū)落后的狀況，越來越多的科學(xué)家開始研究生態(tài)經(jīng)濟效益好、抗旱、抗寒、耐鹽堿的植物材料，所以抗旱性研究已經(jīng)成為植物逆境環(huán)境研究的熱點。因此，在進行植物抗逆性生理生化以及分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上，還應(yīng)該強化各種學(xué)科之間的相互聯(lián)系，將理論知識轉(zhuǎn)化為實踐。加強抗性生理學(xué)和育種學(xué)之間的相互聯(lián)系與結(jié)合，綜合分析有關(guān)抗逆性的各種指標(biāo)，用更加豐富的選育方法選擇新的植株品種[2]。干旱環(huán)境一直以來對農(nóng)作物產(chǎn)量以及對植物生長影響非常大，已經(jīng)成為限制農(nóng)作物生產(chǎn)的主要抑制因素，嚴(yán)重降低了農(nóng)作物的質(zhì)量和產(chǎn)量。水資源的問題一直是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要原因之一，在降水比較多的地區(qū)也存在干旱問題。當(dāng)今全球有很多地區(qū)還有土壤缺水嚴(yán)重的現(xiàn)象，這些干旱地區(qū)水分供不應(yīng)求使得生態(tài)環(huán)境繼續(xù)惡化，即使有的地方土壤水分很充足，但是水分虧缺的現(xiàn)象通常也會發(fā)生，從而影響了植物的正常生長[3]。干旱脅迫研究已在生理生化機制、植物激素信號傳遞[4]和抗逆性基因[5]的表達等方面有了很大的研究進展。因此，在此基礎(chǔ)上，研究干旱脅迫下紫花苜蓿的生長和生理特性的變化規(guī)律，對提高紫花苜蓿植株的水分管理水平，促進紫花苜蓿在干旱高海拔地區(qū)的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義，為紫花苜蓿選育優(yōu)良品種和提高植物的抗旱性提供可靠的科學(xué)依據(jù)[6]。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase, G6PDH, EC1.1.1.49)作為植物戊糖磷酸途徑中的一個關(guān)鍵性調(diào)控酶，它為生物合成提供所需的NADPH和中間產(chǎn)物；另外還參與各種生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，G6PDH和其他脫氫代謝酶類的活性增加，可以降低植物體內(nèi)活性氧水平，說明G6PDH是植物抗氧化過程中的一個抗性酶[10]。G6PDH在植物中有2種存在形式，一種存在于細胞質(zhì)中，被稱為胞質(zhì)型G6PDH，對氧化脅迫以及磷酸化無明顯反應(yīng)；另一種存在于細胞基質(zhì)中，被稱為基質(zhì)型G6PDH，卻在對氧化脅迫的響應(yīng)中被檢測到活性增強，這可能與G6PDH要行使不同調(diào)控功能有關(guān)[11-12]。Wang等[13]通過酶的缺失和替代等研究了G6PDH對非生物脅迫的耐受調(diào)節(jié)機制，并通過基因克隆分析了G6PDHD的氨基酸序列，為進一步探索其生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)。大量研究表明G6PDH參與了環(huán)境脅迫的應(yīng)答[14-19]，探索G6PDH對環(huán)境脅迫的響應(yīng)，將有利于我們進一步認(rèn)識G6PDH的功能，了解植物的防御反應(yīng)機制。

本研究選用紫花苜蓿植物為材料，探索葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在紫花苜蓿干旱耐受性中的響應(yīng)，進一步揭示G6PDH在干旱脅迫下苜蓿植物的抗旱機制方面的作用以及為培育抗旱性品種提供重要的線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的培養(yǎng)

選擇顆粒飽滿、成熟度一致的紫花苜蓿種子為實驗材料。首先將紫花苜蓿種子用自來水沖洗4～5遍，然后用75%的酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗2遍，之后用10%的H2O2浸泡30 min，最后用無菌水沖洗5遍，消毒后的種子接種到MS培養(yǎng)基上進行萌發(fā)。萌發(fā)和培養(yǎng)條件為：溫室28 ℃，黑暗條件下萌發(fā)兩天。等紫花苜蓿的根長到3.0 cm左右時，分別用經(jīng)過濾滅菌的10%、15%、20%的PEG6000溶液模擬干旱脅迫處理紫花苜蓿幼苗10 d，培養(yǎng)箱內(nèi)實行16 h/8 h光周期。處理結(jié)束后，收集紫花苜蓿幼苗，蒸餾水漂洗3遍，濾紙吸干表面水分，立即用于測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 干鮮重、株高、根長的測定

取20棵紫花苜蓿幼苗進行株高和根長的測量，隨即將新鮮的紫花苜蓿幼苗放入烘箱迅速升溫至105 ℃，保持30 min，讓溫度下降至80 ℃，保持24 h后將樣品取出，用電子天平進行稱重。

1.3 MDA含量的測定

丙二醛含量的測定參照Hodges等[20]的方法，稍作改進。取1 g紫花苜蓿葉片在冰浴的研缽內(nèi)加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)并研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)移到離心管中，在4000 r·min-1下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中備用。吸取1 mL上清液加入等體積的0.25%硫代巴比妥酸(TBA)(用10%TCA配制)、1 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl pH 7.6。混合后在95 ℃水浴中加熱30 min，迅速冷卻后置于10000 r·min-1離心10 min。測定440、532 和600 nm處的光吸收值。硫代巴比妥酸過氧化物(thiobarbituric acid-peroxidation，TBARS)含量由公式計算得出：6.45×(OD535-OD600)-0.56×OD440。

1.4 H2O2含量的測定

H2O2含量參照Heath等[21]的方法，略有改動。取1 g紫花苜蓿葉片在冰浴的研缽內(nèi)加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)并研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)移到離心管中，在4000 r·min-1下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至一干凈的離心管中備用。吸取1 mL上清液加入等體積的0.1 mol·L-1Tris-HCl pH 7.6和1 mL KI。該混合液置于黑暗反應(yīng)90 min后測定390 nm處的吸光值。

1.5 蛋白含量的測定

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6支試管，從1～6分別編號，按照表1加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，向各管中加入2.5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，靜置2 min。以空白為參比，在595 nm波長下比色測定吸光度(比色應(yīng)在30 min內(nèi)完成)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)直線方程(標(biāo)準(zhǔn)曲線是以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，OD595為縱坐標(biāo))。

表1 考馬斯亮藍標(biāo)準(zhǔn)溶液配置表Table 1 Coomassie brilliant blue standard solution configuration table

根據(jù)Bradford[22]的方法進行蛋白定量，略有改動。吸取待測蛋白樣品50 μL，放入試管中，加入3 mL考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻后靜置2 min，然后測定595 nm波長下的吸光度值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量(圖1)。

1.6 G6PDH活性的測定

根據(jù)Esposito等[23]的方法提取G6PDH粗酶液，稍作改進。取0.5 g樣品在冰浴的研缽內(nèi)研磨成漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入1 mL提取液[50 mmol·L-1Hepes-Tris (pH 7.8)，3 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1PMSF，1 mmol·L-1DTT]，于4 ℃，12000 r·min-1離心20 min，上清液為粗酶提取液。G6PDH的活性測定，在預(yù)先37 ℃溫浴的反應(yīng)液3 mL反應(yīng)混合液[55 mmol·L-1Hepes-Tris (pH 7.8)，3.3 mmol·L-1MgCl2]中加入50 μL 15 mmol·L-1NaDPNa2，50 μL 15 mmol·L-1G6PDHNa2，最后加入100 μL粗酶提取液。空白對照用蒸餾水代替，啟動反應(yīng)作3次平行。記錄反應(yīng)起始5 min內(nèi)340 nm的吸光值，每30 s記錄一次。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG對紫花苜蓿生長的影響

選取生長14 d、長勢一致的紫花苜蓿幼苗，用不同濃度的PEG(10%, 15%, 20%)處理10 d后，觀察紫花苜蓿幼苗的生長狀態(tài)，測定其葉片中MDA和H2O2的含量以及G6PDH活性的變化。

2.1.1不同濃度PEG對紫花苜蓿幼苗生長的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度PEG處理，紫花苜蓿幼苗的株高、根長及其干重都隨PEG濃度的升高而逐漸降低。PEG很明顯抑制了紫花苜蓿的生長，在PEG濃度為15%時紫花苜蓿幼苗生長開始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，在PEG濃度為20%時處理時間超過一周，紫花苜蓿幼苗出現(xiàn)枯黃致死現(xiàn)象(圖2和圖3)。

圖2 不同PEG濃度處理下的表型Fig.2 The phenotype of different PEG concentrations

圖3 不同濃度PEG處理對紫花苜蓿幼苗株高和根長(A)、鮮重和干重(B)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of PEG treatment on plant height and root length (A), fresh weight and dry weight (B) of alfalfa seedlings不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters mean significant difference (P<0.05).下同 The same below.

2.1.2不同濃度PEG對葉片中MDA含量的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿葉片中MDA的含量先上升后下降，PEG濃度在15%時MDA含量比對照組增加71.8%，在PEG濃度為15%時達到最高值(圖4)。

2.1.3不同濃度PEG對葉片中H2O2含量的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度PEG處理，紫花苜蓿幼苗葉片中H2O2的含量先上升后下降，在PEG濃度為15%時達到最高值，相比對照組H2O2含量增加30.4%。干旱脅迫下植物體內(nèi)H2O2快速積累引起氧化傷害，根據(jù)以上的試驗結(jié)果選擇15%作為干旱脅迫處理的濃度(圖5)。

圖4 不同濃度PEG處理下紫花苜蓿葉片中MDA含量的變化Fig.4 Changes of MDA content in leaves of alfalfa under different concentrations of PEG

圖5 不同濃度PEG處理下紫花苜蓿葉片中H2O2含量的變化Fig.5 Changes of H2O2 content in leaves of alfalfa under different concentrations of PEG

2.1.4不同濃度PEG對G6PDH活性的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度PEG處理，隨著PEG濃度的升高紫花苜蓿葉片中G6PDH活性先升高后降低，紫花苜蓿在15%PEG處理下達到最大值，比對照組G6PDH活性增加了18.5%(圖6)。

圖6 不同濃度PEG處理對紫花苜蓿幼苗葉片中G6PDH活性的影響Fig.6 Effects of different PEG concentrations on the activity of G6PDH in alfalfa leaves

2.2 G6PDH對干旱脅迫的響應(yīng)分析

為進一步研究G6PDH對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長的調(diào)節(jié)，通過預(yù)實驗分別選取0.10, 0.25, 0.50, 1.00 mmol·L-1的Na3PO4進行處理并測定紫花苜蓿幼苗中G6PDH活性變化，發(fā)現(xiàn)0.25 mmol·L-1的Na3PO4即可使G6PDH活性被明顯抑制，因此選用0.25 mmol·L-1Na3PO4[24]處理生長14 d、長勢一致的紫花苜蓿幼苗后，再用不同濃度的PEG(10%、15%、20%)處理10 d后，觀察紫花苜蓿幼苗的生長狀態(tài)，測定其葉片中MDA和H2O2的含量以及G6PDH活性的變化。

2.2.1添加G6PDH抑制劑Na3PO4后干旱脅迫下幼苗的生長變化 干旱脅迫(15%PEG)下，紫花苜蓿株高、根長及干重分別比對照組有所降低，用0.25 mmol·L-1Na3PO4處理后進一步抑制了紫花苜蓿幼苗的株高、根長及其干重。添加抑制劑時紫花苜蓿幼苗的生長受到了抑制，在PEG和抑制劑的共同作用下紫花苜蓿幼苗的生長進一步受到抑制，這時植株開始出現(xiàn)發(fā)黃枯萎的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明干旱脅迫下紫花苜蓿葉片中G6PDH參與了紫花苜蓿植株的生長過程(圖7和圖8)。

2.2.2添加G6PDH抑制劑后干旱脅迫下MDA含量的變化 丙二醛的積累對于膜及細胞會造成一定的傷害，所以MDA的含量可以反映在遭受逆境時的傷害程度。干旱脅迫(15%PEG)明顯提高了紫花苜蓿葉片中MDA的含量，用0.25 mmol·L-1Na3PO4處理后使得紫花苜蓿葉片中MDA含量都明顯提高，相比對照組增長了28.4%。用PEG和Na3PO4共同作用下紫花苜蓿葉片中丙二醛的含量也有明顯提高，比對照組增長了65.7%，比Na3PO4單獨作用增長了26.9%。結(jié)果進一步表明了紫花苜蓿幼苗通過增加G6PDH的活性來抵抗干旱脅迫的環(huán)境，避免受到嚴(yán)重的氧化傷害，進而達到增強植株對干旱耐受性的目的(圖9)。

圖7 添加G6PDH抑制劑后干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗Fig.7 Phenotype of alfalfa seedlings under drought stress after adding G6PDH inhibitor

圖9 添加G6PDH抑制劑后干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片中MDA含量的變化Fig.9 Changes of MDA content in leaves of alfalfa seedlings under drought stress by adding G6PDH inhibitor

圖10 添加G6PDH抑制劑后干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片中H2O2含量的變化Fig.10 Changes of H2O2 content in leaves of alfalfa seedlings under drought stress by adding G6PDH inhibitor

2.2.3添加G6PDH抑制劑后干旱脅迫下H2O2含量的變化 干旱脅迫(15%PEG)明顯提高了紫花苜蓿葉片中H2O2的含量，用0.25 mmol·L-1Na3PO4處理后使得紫花苜蓿葉片中H2O2含量明顯升高，Na3PO4單獨處理的H2O2含量比對照組增長了22%，用PEG和Na3PO4共同作用下紫花苜蓿葉片中H2O2含量有明顯提高，比對照組增長了45%，比Na3PO4單獨作用增長了18%(圖10)。

圖11 添加G6PDH抑制劑后干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗G6PDH活性的變化Fig.11 Changes of G6PDH activity in alfalfa seedlings under drought stress after adding G6PDH inhibitor

2.2.4添加G6PDH抑制劑后干旱脅迫下G6PDH活性的變化 干旱脅迫(15%PEG)下，紫花苜蓿幼苗葉片中G6PDH活性明顯升高。用0.25 mmol·L-1Na3PO4處理后紫花苜蓿葉片中G6PDH活性明顯下降，在PEG和抑制劑的共同作用下紫花苜蓿幼苗葉片中G6PDH的活性進一步下降，Na3PO4單獨作用下的G6PDH的活性比對照組降低了20.9%，用PEG和Na3PO4共同作用下紫花苜蓿葉片中G6PDH的活性比對照組下降了46.8%，比Na3PO4單獨處理下降了21.4%，表明紫花苜蓿通過增加G6PDH活性來抵抗干旱環(huán)境，減少對植株的傷害，以達到增強紫花苜蓿植株對干旱耐受性的響應(yīng)(圖11)。

3 討論

植物遭受干旱脅迫時生長受到抑制，遭受脅迫程度不同植株會表現(xiàn)出不同的表型特征，如：輕中度干旱脅迫時植株株高降低，生長遲緩等特征，干旱脅迫增加時，植株會失水萎蔫、葉片卷曲變黃，脅迫程度再增加有可能導(dǎo)致植株枯萎或者死亡。本研究中使用0～20%PEG處理，首先通過觀察其表型變化分析紫花苜蓿幼苗的干旱耐受范圍，結(jié)果表明，當(dāng)PEG濃度達到20%時，紫花苜蓿幼苗的地上部分基本不生長(圖2和圖3)，初步可以判斷紫花苜蓿幼苗對干旱的耐受濃度應(yīng)該小于20%PEG。但是PEG濃度低于20%時，紫花苜蓿幼苗受損的程度仍不明確，因此檢測了相關(guān)的傷害指標(biāo)。細胞膜是保護植物細胞免受外界傷害的有力屏障，也是植物遭受逆境脅迫時首先遭到攻擊的部位。丙二醛是植物在逆境中組織或器官受到傷害而產(chǎn)生的脂質(zhì)氧化反應(yīng)的最終代謝物，會引起核酸、蛋白質(zhì)等大分子的交聯(lián)聚合[25]。同樣，其含量以及H2O2含量也可以作為評價植物在抗逆性中的重要指標(biāo)[26]。干旱脅迫也會導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的大量積累，從而引起氧化損傷。結(jié)果表明，隨PEG濃度的增加，MDA和H2O2的含量先增加后減少(圖4和圖5)，15%PEG處理時積累量最大，推測此時出現(xiàn)活性氧爆發(fā)現(xiàn)象，并確定15%PEG為脅迫濃度。大量研究表明，G6PDH參與了植物對多種環(huán)境脅迫的耐受性響應(yīng)，如干旱、鹽脅迫、高溫、病原菌侵染等[24,27-29]。G6PDH在植物干旱耐受性中的響應(yīng)也有報道。如，Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，干旱誘導(dǎo)了大豆(Glycinemax) G6PDH活性的增加，而且其活性水平在抗旱性強的品種中要高于抗旱性弱的品種。Wang等[13]也發(fā)現(xiàn)干旱脅迫增強了大多數(shù)根中G6PDH活性，并且提出了一個G6PDH在大豆干旱適應(yīng)性中的模式圖，強調(diào)干旱脅迫誘導(dǎo)了ABA的積累，進而通過激活NADPH氧化酶增強了H2O2的產(chǎn)生；H2O2作為下游信號分子通過調(diào)節(jié)G6PDH磷酸化過程而激活了胞質(zhì)G6PDH活性；增強的胞質(zhì)G6PDH活性通過調(diào)節(jié)ASA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶活性從而增加了ASA和GSH含量；高水平的ASA和GSH能夠增強植物清除ROS能力，以此維持細胞內(nèi)適宜的ROS水平，從而避免細胞遭受氧化損傷。類似地，本研究結(jié)果表明PEG誘導(dǎo)了G6PDH活性的增加(圖6)，G6PDH抑制劑處理后紫花苜蓿幼苗的生長較對照組和干旱脅迫處理組受到的抑制更加嚴(yán)重(圖7和圖8)，相應(yīng)的MDA和H2O2含量較單獨干旱脅迫下的有所增加(圖9和圖10)，很明顯G6PDH活性被抑制后加劇了干旱脅迫對植物引起的損傷，說明G6PDH在響應(yīng)干旱脅迫中起了一定的調(diào)節(jié)作用，結(jié)合Wang等[13]的研究結(jié)果推測G6PDH在紫花苜蓿中可能通過調(diào)節(jié)自身活性來促使植物體內(nèi)其他保護性酶或者信號分子的產(chǎn)生來響應(yīng)干旱脅迫引起的氧化損傷，從而抵御干旱脅迫。所以，紫花苜蓿幼苗是通過增加G6PDH的活性來抵抗干旱脅迫環(huán)境以避免植株受到嚴(yán)重的氧化損傷，進而達到增強植株對干旱耐受性的目的，證明G6PDH可能參與調(diào)節(jié)了植物對干旱脅迫的響應(yīng)。

4 結(jié)論

紫花苜蓿葉片中MDA、H2O2含量以及G6PDH活性隨PEG濃度0、10%、15%、20%先上升后下降，15%處最高；在PEG濃度為15%時，MDA含量、H2O2含量以及G6PDH活性分別比對照組增長了71.8%、30.4%、18.5%；故采用PEG模擬紫花苜蓿干旱脅迫的最佳處理濃度為15%。

添加G6PDH的抑制劑Na3PO4的紫花苜蓿葉片中MDA含量以及H2O2含量都呈上升趨勢，分別比對照組增長了65.7%和45.0%；抑制劑作用下的G6PDH活性比對照組降低了46.8%；干旱脅迫和抑制劑作用下葉片中MDA和H2O2含量分別較干旱脅迫下的增長28.4%和19.9%，G6PDH的活性明顯降低了49.4%；因此，G6PDH可能參與調(diào)節(jié)了植物對干旱脅迫的響應(yīng)。

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