抗菌肽對稻瘟病菌的抑菌活性測定

毛雪琴，劉 偉，邱海萍，張 震，柴榮耀，王教瑜，王艷麗，宋鳳鳴，孫國昌*

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

稻瘟病是由子囊菌Magnaporthegrisea引起的，是水稻生產(chǎn)上的重要病害[1-2]。目前，稻瘟病的防治主要以抗病育種和化學(xué)防治為主，化學(xué)防治高效、簡單，然而其大量、廣泛的使用，不僅帶來病原菌耐藥性問題，同時易造成農(nóng)藥殘留、破壞生態(tài)平衡等，因而在加強抗病育種工作的同時，高效、低毒、低殘留及低選擇壓的殺菌劑開發(fā)，仍是稻瘟病防治研究的重要內(nèi)容。

近年來，通過篩選對病原菌具有抑菌活性的天然多肽，并利用基因工程手段來獲得多肽產(chǎn)物的研究，成為植物病害防控的新熱點?？咕?antimicrobial peptides)是天然免疫的重要介質(zhì)，是生物機體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的短肽[3-4]。它不僅能抗原蟲、病毒或腫瘤細(xì)胞，而且抗多種細(xì)菌或真菌，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌均有抑殺作用[5-6]?？咕木哂欣砘再|(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥性等特點，因而可作為農(nóng)用抗生素的理想替代品，而且基因工程技術(shù)的發(fā)展，極大促進(jìn)了抗菌肽的研究和開發(fā)，通過抗菌肽基因的克隆與表達(dá)，使其大量生產(chǎn)成為可能。

本文以廣譜抗菌肽Caseicin A序列為基礎(chǔ)，通過人工設(shè)計編碼，委托Invitrogen公司合成的28種抗菌肽，探討了其對稻瘟病菌的孢子萌發(fā)、附著胞形成和菌絲生長等的影響。根據(jù)抑菌活性測定結(jié)果，利用盆栽試驗評價了抗菌肽對水稻稻瘟病的防治效果，為抗菌肽產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和抗菌肽

稻瘟病菌株2011-8-2，由本實驗室分離保存；抗菌肽以廣譜抗菌肽Caseicin A序列為基礎(chǔ)人工設(shè)計編碼，由Invitrogen公司合成，抗菌肽序列及相關(guān)信息見表1。

1.2 利用孢子萌發(fā)法初篩對稻瘟病菌具有抑菌活性的抗菌肽

1.2.1 稻瘟菌孢子制備

將菌株2011-8-2從保存的稻節(jié)培養(yǎng)基活化轉(zhuǎn)接至CM培養(yǎng)基平板中，于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3～5 d。將上述活化后的菌株接種在燕麥培養(yǎng)基上于28 ℃黑暗培養(yǎng)，3～5 d后于黑光燈下照射5～7 d，誘導(dǎo)分生孢子產(chǎn)生。向平板中加10 mL無菌水，將孢子洗出并過濾，用無菌水制成濃度為1×105mL-1的孢子懸浮液備用。

1.2.2 抗菌肽的溶解

配制1×TE Buffer(500 mL)，方法：量取1 mol·L-1Tris-HCl Buffer(pH值8.0)5 mL、0.5 mol·L-1EDTA(pH值8.0)1 mL，將上述溶液加入到500 mL試劑瓶中，加入約400 mL ddH2O均勻混合；將溶液定容到500 mL后，調(diào)節(jié)pH值為7.5，高溫高壓滅菌；室溫保存?zhèn)溆?。根?jù)抗菌肽(表1)干粉的質(zhì)量，加入相應(yīng)量的1×TE Buffer，振蕩混勻，將各抗菌肽終濃度調(diào)至20 mmol·L-1。

表1 試驗所涉及的抗菌肽相關(guān)信息

1.2.3 主要培養(yǎng)基

CM培養(yǎng)基配方(1 L)：20×Nitrate salts 50 mL，微量元素1 mL，葡萄糖10 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，酪蛋白氨基酸1 g，維生素1 mL，加ddH2O至1 L，調(diào)節(jié)pH值至6.5；固體CM需另加18 g瓊脂粉。分裝后，高壓滅菌，室溫保存。

20×Nitrate salts配方(1 L)：NaNO3120 g，KCl 10.0 g，MgSO410.0 g，KH2PO430.0 g，加ddH2O至1 L，4 ℃避光保存。

1 000×Vitamin solution(維生素)配方(1 L)：Biotin(維生素H)0.01 g，Pyridoxin(吡哆醇)0.01 g，Thiamine[硫胺素(維生素B1)]0.01 g，Riboflavin(核黃素)0.01 g，PABA(p-aminobenzonic acid)對氨基苯甲酸0.01 g，Nicotinic acid(煙酸)0.01 g，加ddH2O至1 L，4 ℃避光保存。

1 000×Trace Elements 微量元素配方(1 L)：ZnSO4·7H2O 2.2 g，H3BO31.1 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g，CoCl2·6H2O 0.17 g，CuSO4·5H2O 0.16 g，Na2MoO4·5H2O 0.15 g，Na4EDTA 5 g，加ddH2O至1 L，4 ℃避光保存。

燕麥培養(yǎng)基配方(1 L)：稱取50 g燕麥片置于1 L蒸餾水，沸水浴中加熱1 h，之后用紗布濾掉燕麥渣，用蒸餾水補足到1 L，加瓊脂粉18 g，分裝后，高壓滅菌，常溫保存。

1.2.4 孢子萌發(fā)抑制測定

將實驗所需的凹玻片高壓滅菌，將不同濃度的抗菌肽分別加入到1.2.1節(jié)的孢子懸浮液中，使總體積為100 μL的體系中多肽濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mmol·L-1等不同梯度，每個梯度4個重復(fù)，以不加抗菌肽為空白對照(表2)。將上述體系加到滅菌后的凹玻片上，并置于加墊濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于28 ℃黑暗保濕培養(yǎng)，24 h后對孢子的萌發(fā)情況進(jìn)行觀察，記錄不同濃度下孢子萌發(fā)、附著胞形成等情況，統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計算孢子萌發(fā)抑制率和附著胞形成抑制率，試驗重復(fù)2次。孢子萌發(fā)抑制率=(對照的孢子萌發(fā)率-處理的孢子萌發(fā)率/對照的孢子萌發(fā)率)×100；附著胞抑制率=(對照的附著胞形成率-處理的附著胞形成率/對照的附著胞形成率)×100。

1.3 利用平板抑菌法篩選對稻瘟病菌菌絲生長具有抑制作用的抗菌肽

從活化后的稻瘟病菌株2011-8-2的CM平板上，取直徑為5 mm的菌餅接種到一個新的CM平板的中心點上，于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。將1.2節(jié)中選出的對稻瘟病菌孢子萌發(fā)具有抑制效果的抗菌肽，濃度調(diào)整至0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mmol·L-1等不同梯度。將滅菌后的牛津杯放入上述培養(yǎng)3 d后的菌株平板中，距離菌餅3 cm處均勻擺放4個牛津杯，其中3個牛津杯中加入不同濃度的抗菌肽，第4個牛津杯中加入清水作為對照，于28 ℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，觀察稻瘟病菌的生長情況，記錄抗菌肽對稻瘟病菌的抑制效果。

1.4 稻瘟病盆栽防效測定

1.4.1 水稻苗的培養(yǎng)

將水稻品種豐兩優(yōu)香1號的種子經(jīng)催芽后播種于裝有育秧土的盆缽里，每盆均勻撒播20粒種子，播種后放置水槽中，水槽保水深度為5 cm，酌施氮肥，保持嫩綠，選擇其中長勢一致的10株3葉1心期水稻苗備用。

1.4.2 稻瘟病接種

用孢子懸浮液噴霧接種，孢子濃度為1×105mL-1，接種量以所有葉片上布滿孢子液為限。接種后置于26 ℃的恒溫室內(nèi)，遮光保濕24 h，以促進(jìn)病情的發(fā)展。

1.4.3 抗菌肽處理

在稻瘟病菌接種24 h后，將p390和p415這2種抗菌肽分別稀釋至0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mmol·L-1等不同濃度，均勻噴施于葉面至全部濕潤，設(shè)清水處理作空白對照，每處理4次重復(fù)。待藥液自然風(fēng)干后，將處理后的水稻置于26～28 ℃的恒溫室內(nèi)，12 h光暗交替，相對濕度90%以上的條件下培養(yǎng)。6 d后調(diào)查，病害分級、防效計算參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則》。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對孢子萌發(fā)的抑制效果

采用孢子萌發(fā)法測定了28種抗菌肽對稻瘟病菌的抑制效果，結(jié)果表明28種抗菌肽中對稻瘟病菌孢子萌發(fā)有抑制作用的有10個：p390、p391、p392、p393、p397、p409、p412、p415、p416、p417。其中，抗菌肽p390對稻瘟病菌的孢子萌發(fā)和附著胞的形成有顯著的抑制作用，最低處理濃度0.1 mmol·L-1時，對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到100%，完全抑制了稻瘟菌孢子的萌發(fā)，對附著胞的分化和發(fā)育抑制率也達(dá)到100%(圖1)。當(dāng)處理濃度為0.2 mmol·L-1時，對稻瘟病菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)100%的抗菌肽有p415和p416，對附著胞的分化和發(fā)育抑制率達(dá)100%的抗菌肽有p391、p415和p416。綜合以上結(jié)果，我們篩選出對稻瘟病菌孢子萌發(fā)有較好抑制效果的抗菌肽為p390、p415和p416(表2～3)。

A，清水對照；B，p390多肽濃度為0.1 mmol·L-1；C，p390多肽濃度為0.2 mmol·L-1；D，p390多肽濃度為0.4 mmol·L-1；E，p390多肽濃度為0.8 mmol·L-1；F，p390多肽濃度為1.6 mmol·L-1；G，清水對照；H，p395多肽濃度為0.2 mmol·L-1；I，p395多肽濃度為0.4 mmol·L-1；J，p395多肽濃度為0.8 mmol·L-1；K，p395多肽濃度為1.6 mmol·L-1；L，p395多肽濃度為3.2 mmol·L-1圖1 抗菌肽對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制效果

2.2 平板抑菌法篩選抗菌肽結(jié)果

通過平板抑菌法測定了抗菌肽p390、p415和p416對稻瘟病菌菌絲生長的抑制效果，發(fā)現(xiàn)抗菌肽p416對稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用不明顯?？咕膒390和p415在處理濃度達(dá)到1.6 mmol·L-1時，出現(xiàn)了明顯的抑菌圈。圖2為不同濃度的抗菌肽p390對稻瘟病菌菌絲生長的抑制效果。

A，清水對照；B，p390濃度為0.1 mmol·L-1；C，p390濃度為0.2 mmol·L-1；D，p390濃度為0.4 mmol·L-1；E，p390濃度為0.8 mmol·L-1；F，p390濃度為1.6 mmol·L-1圖2 不同濃度的抗菌肽p390對稻瘟病菌絲生長的抑制效果

2.3 抗菌肽防治水稻稻瘟病盆栽試驗

選用抗菌肽p390和p415進(jìn)行了防治水稻稻瘟病溫室盆栽試驗。結(jié)果表明，抗菌肽p390、p415對稻瘟病具有較好的防治效果，隨著抗菌肽濃度的增加防治效果明顯加強，當(dāng)抗菌肽p390濃度為0.2 mmol·L-1時，防治效果達(dá)到50%以上，而p415濃度為0.8 mmol·L-1時，防治效果也達(dá)到50%以上，p390的防治效果好于p415(表4)。

表2 16種抗菌肽對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制效果

表3 12種抗菌肽對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制效果

表4 在溫室條件下p390、p415對水稻稻瘟病的 防治效果

3 小結(jié)與討論

本研究對源自酪蛋白Casein的28種抗菌肽進(jìn)行了其對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制作用測定，結(jié)果表明28種抗菌肽中對稻瘟病菌孢子萌發(fā)有抑制作用的有p390、p391、p392、p393、p397、p409、p412、p415、p416和p417。其中，濃度較低時，對稻瘟病菌萌發(fā)的抑制率就達(dá)到100%的抗菌肽有p390、p415和p416。將篩選出的抗菌肽p390、p415和p416進(jìn)行平板抑菌試驗，結(jié)果表明，p416對稻瘟病菌的菌絲生長基本沒有抑制作用，而抗菌肽p390和p415對稻瘟病菌的菌絲生長有一定的抑制效果，隨著濃度的增加，抑制效果逐漸增強。綜合上述實驗結(jié)果，進(jìn)一步研究了p390和p415這2種抗菌肽對稻瘟病盆栽防治效果。盆栽防治試驗表明這2種抗菌肽對水稻稻瘟病具有一定的防治效果。當(dāng)抗菌肽p390濃度為0.2 mmol·L-1，p415濃度為0.8 mmol·L-1時，防治效果均達(dá)到50%以上，抗菌肽p390的防治效

果優(yōu)于p415。以上研究結(jié)果表明抗菌肽p390在較低濃度時，對稻瘟病有較好的抑制作用，表明該抗菌肽有作為農(nóng)用殺菌劑進(jìn)行開發(fā)利用的可能性。

[1] COUCH B C，KOHN L M.A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species，Magnaportheoryzae，fromM-grisea[J].Mycologia，2002，94(4):683-693.

[2] ASHIKAWA I，HAYASHI N，YAMANE H，et al. Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance[J].Genetics，2008，180(4):2267-2276.

[3] 楊陽，孫紅瑜，金光耀，等. 抗菌肽的作用機理及應(yīng)用前景[J]. 中國林副特產(chǎn)，2010，6(1)：103-104.

[4] 刁昱文，趙紅蕾，高宇，等. 抗菌肽的研究進(jìn)展[J]. 河北科技師范學(xué)院學(xué)報，2011，25(1)：61-65.

[5] 陳星星，陳宏惠，鄭新添. 抗菌肽的研究進(jìn)展及其在畜牧業(yè)上的運用[J]. 福建畜牧獸醫(yī)，2011,33(1)：20-22.

[6] 鄔曉勇，何鋼，顏軍，等. 抗菌肽抑菌活性測定方法的研究[J]. 生物學(xué)通報，2011，46(4)：44-47.