HPLC法測定不同林下黃連中5種生物堿含量

楊 繁，楊 旭

(湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430200)

黃連(CoptischinensisFranch.)為毛茛科黃連屬(CoptisSalisb.)多年生草本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》；分布于四川、貴州、湖南、湖北、陜西南部等地[1]。湖北地區(qū)一般生長在海拔1 000～1 800 m的山區(qū)，喜陰濕涼爽氣候，屬喜陰植物，忌強烈的直射光照射，喜弱光、怕強光。傳統(tǒng)的黃連種植方式以簡易棚栽為主，該方式除了占用大量的土地資源，還需人工搭棚遮陰，消耗大量的林木資源和勞動力。根據(jù)調(diào)查顯示，每種植1 hm2黃連需要破壞3 hm2林地，消耗150 m3木材[2]。隨著人口的不斷增加，土地越來越緊張，人們保護森林資源、保護生態(tài)環(huán)境的意識也在逐步增強，對土地的開發(fā)利用已走上了綜合立體的模式。為充分利用林地資源，發(fā)展林下經(jīng)濟已成為林區(qū)群眾致富的一個重要途徑[3]。

根據(jù)黃連怕光喜陰的生物學(xué)特性，在恩施州新塘鄉(xiāng)太山廟黃連生產(chǎn)基地(30°09′45″N， 109°48′63″E)，海拔約1 780 m，選取與黃連適生海拔、土壤等立地條件相近的厚樸林(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.)、黃柏林[Platycladusorientalis(Linn.) Franco.]、杉木林[Cunninghamialanceolata(Lamb.)]、休耕地(CK)[4-5]作為試驗地。通過現(xiàn)有林地林冠結(jié)構(gòu)對光、熱、水等的再分配，使林下的生態(tài)環(huán)境適于喜濕、耐蔭黃連的生長發(fā)育，以期為林下黃連的栽培種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年10月在各試驗地栽植2年生黃連苗，補苗、病害防治、除草、施肥等均按傳統(tǒng)種植方式統(tǒng)一進行。2016年10月采集栽培種植黃連植株的根、莖、葉、須根，分別測定各器官的鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿和巴馬汀含量。

1.2 方法

采用HPLC法。色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(V∶V為65∶35，每100 mL甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液中加十二烷基硫酸鈉0.6 g，再用甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.5)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長350 nm，柱溫35 ℃。

混合對照品溶液的制備。精密稱量對照品適量，加甲醇，制成每1 mL對照溶液含鹽酸小檗堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、巴馬汀和鹽酸藥根堿分別為90.51、13.20、29.30、24.70、12.01 μg的混合溶液。

供試品溶液的制備：取黃連樣品粉末(過2號篩)約0.2 g，精密稱量，置具塞錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸(V∶V為100∶1)的混合溶液50 mL，密塞，稱量；超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻，再稱量，用甲醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，過濾；精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3 標準曲線的制備

精密吸取混合對照品溶液1、2、3、4、5 μL，進行高效液相色譜測定。以進樣量(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，分別得出5種生物堿的標準曲線。對照品鹽酸藥根堿，y=518.94x-21.463，r=0.999 1；對照品表小檗堿，y=315.74x+12.389，r=0.998 2；對照品鹽酸黃連堿，y=1265.9x-124.39，r=0.998 7；對照品巴馬汀，y=1 038.7x-103.9，r=0.999 9；對照品鹽酸小檗堿，y=1 349.7x-150.25，r=0.999 8。

1.4 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，利用高效液相色譜儀測定。以混合對照品的峰面積為對照，用外標法分別計算待測樣品中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿和巴馬汀的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計整理使用Excel軟件，數(shù)據(jù)的計算與分析主要使用IBM SPSS軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林分下黃連的生物堿含量

由表1可知，不同林分下黃連植株中5種生物堿含量差異較大，鹽酸小檗堿含量為20.03%～3.45%，鹽酸黃連堿2.61%～0.11%，表小檗堿2.41%～0.03%，巴馬汀1.64%～0.07%，鹽酸藥根堿0.49%～0.09%；杉木林下種植的黃連植株鹽酸藥根堿和表小檗堿的含量最高；黃柏林下種植的黃連植株鹽酸黃連堿平均含量最高。與2015版藥典規(guī)范對比可知，不同林分下種植的黃連植株的傳統(tǒng)入藥部位根部的5種黃連生物堿含量均符合《中華人民共和國藥典(2015)》要求[6]，表明林下種植黃連與休耕地栽培黃連藥效成分一致，是值得推廣應(yīng)用的栽培模式。

2.2 不同部位黃連的生物堿總含量

由于單一指標最高值出現(xiàn)在不同的林下種植模式中，為了全面客觀地分析數(shù)據(jù)，從生物堿總量的角度，對黃連不同部位的生物堿總含量進行分析。由表2可知，生物堿總量的整體規(guī)律為根>莖>須根>葉，與曾燁等[7]的研究結(jié)果相一致；根部的生物堿總含量均值達24.90%，莖部的生物堿總含量均值次之，達到7.19%，須根部的生物堿總含量均值為6.54%，葉片的生物堿總含量均值最低，為5.25%。分別對根、莖、須根、葉4個部位的黃連生物堿含量進行不同林分之間的單因素方差分析得知，4個不同部位的黃連生物堿含量在不同林分下均存在顯著差異。

表1 黃連各器官5種生物堿的含量

注：中華人民共和國藥典(2015)要求黃連中生物堿含量表小檗堿≥0.8%，鹽酸黃連堿≥1.6%，巴馬汀≥1.5%，鹽酸小檗堿≥5.5%。

表2 不同部位的黃連生物堿總含量

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

黃柏林地與休耕地黃連的根部生物堿含量無顯著差異，其他樣地兩兩之間的黃連根部生物堿含量均存在顯著差異；黃柏林地和杉樹林地的莖部黃連生物堿含量無顯著性差異；杉木林地與修耕地黃連的須根生物堿總含量無顯著性差異?？紤]到黃連的主要入藥部位為根、莖部位，綜合分析得出，厚樸、黃柏、杉木3種不同林分中，黃柏林下種植黃連的栽培模式較好，其黃連品質(zhì)明顯優(yōu)于厚樸林地和杉木林地種植的黃連。

3 討論

從單一成分來看，黃柏林下的黃連所含鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿分別比休耕地黃連高，杉木林下的黃連所含鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿分別比休耕地黃連高，表明黃柏、杉木

林下種植黃連可提高黃連品質(zhì)。厚樸林下種植的黃連品質(zhì)相對于休耕地略低，原因可能與高海拔的氣候條件相關(guān)，在高海拔地區(qū)，落葉樹種的萌芽時間較晚，達不到黃連幼苗發(fā)育期的遮陰要求。

從生物堿總含量來看，黃柏林下栽培黃連的5種生物堿總含量比休耕地黃連高。黃連傳統(tǒng)入藥部位根莖部的生物堿總含量占整株生物堿總量比重最大，與次級代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)的選擇性代謝累積有一定關(guān)系。同時，須根和葉的生物堿總含量占整株生物堿總量的比值高，建議可發(fā)掘黃連非傳統(tǒng)入藥部位的利用價值，以提高黃連的整株利用率[8]。

總體來看，林藥復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)出黃連的有效成分含量與傳統(tǒng)搭棚栽培黃連的有效成分含量相近，表明林藥復(fù)合經(jīng)營在節(jié)省人工勞動成本的同時，對于黃連品質(zhì)的提升和田間管理都有著積極作用。發(fā)展黃連的林下種植不僅可以提高森林覆蓋率，充分利用林地資源，提高林地使用價值，還可節(jié)省因搭棚遮陰耗費的勞動力和原材料。黃柏林下栽培黃連模式可在我國適宜的黃連產(chǎn)地進行推廣。

[1] 中國科學(xué)院植物志委員會. 中國植物志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

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[3] 李乾友, 朱富華, 蔡夢陽. 杉木林下黃連種植技術(shù)[J]. 湖北林業(yè)科技, 2010 (2): 70-72.

[4] 李春民, 章承林, 周忠誠, 等. 鄂西南山區(qū)不同幼林林下黃連種植模式優(yōu)化研究[J]. 經(jīng)濟林研究, 2013, 31(1): 119-123.

[5] 李春民, 徐自錦, 章承林, 等. 林下黃連種植模式研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014 (12): 2817-2820.

[6] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2015) [M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015.

[7] 曾燁, 王學(xué)奎, 薛翔楠, 等. 湖北利川黃連不同生長齡期主要生物堿的分布及變化[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2013, 19(11): 123-126.

[8] 田浩, 石瑤, 吳麗華, 等. 不同產(chǎn)地不同部位云黃連生物堿成分累積研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2012, 34(5): 570-576.